HOX Proteine bei der Leukämieentstehung - Untersuchungen zum molekularen Transformationsmechanismus

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2010-10-11
Issue Year
2010
Authors
Buhl, Sebastian
Editor
Abstract

An overexpression of homeobox (HOX) genes could be shown in many acute leukemias and the expression of HOXA9 and HOXA7 correlates with a negative prognosis. These results implicate that an aberrant expression of HOX genes is probably involved in the etiology of many leukemias. Besides the importance of HOX proteins in hematopoiesis only a few studies investigating their molecular mechanism of transformation of have been performed. For a better understanding of the transforming mechanism of HOX proteins, transformation assays with hematopoietic precursors were performed in this thesis. These studies confirmed, that overexpression of already identified Hoxa9 and Meis1 target genes RhoJ, Klf9, Tst, c-Myb, Nucb2m Mylk, Mef2c, Mybl2 and C/ebpa in primary murine bone marrow cells has no transforming effect. Closer examination of C/ebpa showed neither a transforming effect of the isoforms p30, nor a direct regulation by Hoxa9. To identify new HOXA target genes the transforming mechanism of anterior HOXA genes was analysed. Transplantation experiments showed a full malignant transformation of hematopoetic precursors by cotransduction with anterior HOXA genes HOXA1, HOXA4 and HOXA6 and Meis1. Beside that the experiments showed that the transforming effect at least partially due to a direct regulation of c-Myb by HOXA proteins. In addition the transforming capacity of anterior HOXA genes was not mediated by Hoxa9. Gene expression analysis of Hoxa9 respectively HOXA1 transformed celllines was performed. By comparison of the datasets 61 genes were identified that were upregulated by both HOXA genes (A1 and A9) significantly and because of this are probably essential for HOXA induced leukemogenesis. Examination of these genes pointed on three promising targets Vav2, Rapgefl1 and Rasal2, that are involved in the signal transduction through small GTPases that could play a role in transformation through HOXA genes. For a better understanding of the molecular mechanism of transformation through HOXA proteins, structure-function-analysis were performed. By the use of bone marrow transformation tests with truncated HOXA1-constructs could be shown, that a truncation of 33 aminoacids of the protein at the N-terminus was the largest deletion tolerated that could still maintain an albeit reduced transformation activity. More extensive N-terminal truncations or the deletion of the C-terminal homeodomain led to the complete loss of the transforming potential of the HOXA1 protein. Experiments with HOXA1 and HOXA9 swap mutants showed, that the domains essential for transformation can be swapped between the HOXA homologues, without disturbing their transforming potential.

Abstract

In vielen akuten Leukämien wurde eine Überexpression von Homöobox (HOX) Genen nachgewiesen. Gerade die Expression von HOXA9 und HOXA7 korreliert dabei mit einer sehr schlechten Prognose für die Patienten. Diese Befunde deuten darauf hin, dass eine aberrante Expression von HOX Genen möglicherweise ursächlich für die Entstehung vieler Leukämien ist. Trotz der Bedeutung dieser wichtigen hämatopoietischen Regulatoren für die Leukämogenese existieren bislang jedoch nur wenige Untersuchungen zum molekularen Transformationsmechanismus von HOX Proteinen. Um den transformierenden Mechanismus der HOX Proteine besser zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Promotionsarbeit Transformationstest an hämatopoietischen Vorläuferzellen durchgeführt. Hierbei wurde gezeigt, dass die Überexpression der bereits identifizierten Hoxa9 und Meis1 Zielgene RhoJ, Klf9, Tst, c-Myb, Nucb2, Mylk, Mef2c, Mybl2 und C/ebpa in primären murinen Knochenmarkszellen keine transformierende Wirkung hat. Bei näherer Untersuchung des C/ebpa konnte weder eine transformierende Wirkung der Isoform p30 nachgewiesen noch konnte eine direkte Regulation des Gens durch Hoxa9 verifiziert werden. Um neue HOXA Zielgene zu identifizieren, wurde daraufhin der transformierende Mechanismus der anterioren HOXA Gene analysiert. Transplantationsexperimente zeigten eine vollständige maligne Transformation der hämatopoietischen Vorläuferzellen durch die Kotransduktion der anterioren HOXA Gene HOXA1, HOXA4 und HOXA6 und Meis1. Zudem ergaben die Untersuchungen, dass die transformierende Wirkung der Proteine unter anderem auf einer Regulation von c-Myb beruht und diese transformierende Wirkung unabhängig von Hoxa9 ist. Aufgrund des Hoxa9 unabhängigen, jedoch ähnlichen Transformationsmechanismus wurden Genexpressions-Analysen von HOXA1 bzw. Hoxa9 transformierten Zelllinien erstellt. Durch einen Abgleich dieser Datensätze wurden 61 Gene identifiziert, die von beiden HOXA Proteinen (A1 und A9) signifikant hochreguliert werden und damit möglicherweise die essentiellen Zielgene der HOXA induzierten Leukämogenese sind. Eine Überprüfung dieser Gene ergab mit Vav2, Rapgefl1 und Rasal2 drei vielversprechende Zielgene, die involviert bei der Signaltransduktion über kleine GTPasen sind und deren Regulation eine Rolle bei der Transformation durch HOXA Gene spielen könnte. Für ein besseres Verständnis des molekularen Transformationsmechanismus der HOXA Proteine wurden Struktur-Funktions-Analysen durchgeführt. Über Knochenmarks-transformationstests mit verkürzten HOXA1-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass lediglich eine N-terminale Verkürzung des Proteins um 33 Aminosäuren noch eine verringerte transformierende Wirkung aufrecht erhält. Weitere N-terminale Verkürzungen sowie die Deletion der C-terminalen Homöodomäne führten zu einem vollständigen Verlust des transformierenden Potentials des HOXA1 Proteins. Untersuchungen mit HOXA1 und HOXA9 Austauschmutanten ergaben, dass die Bereiche der Proteine, für die eine essentielle Bedeutung bei der Transformation gezeigt werden konnte, zwischen den HOXA Homologen getauscht werden können, ohne dabei das transformierende Potential zu beeinträchtigen.

DOI
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