Säuresensitive Ströme bei kultivierten Hinterwurzelganglien und deren Bedeutung für die Funktion renaler Afferenzen
Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-02-17
Issue Year
2011
Authors
Heersink, Claudia
Editor
Abstract
- Introduction One of the best known mechanisms of the pathogenesis of hypertension is an increased water- and sodium-retention and augmented activation of the renin-angiotensin-aldosterone system. An elevated activation of sympathetic nerves to the kidney also increases tubular sodium reabsorption, renin release and renal vascular resistance and accelerates the development of hypertension (Grisk O & Rettig R, 2003). These changes are received by renal sensory receptors and transmitted over afferent neurons - these are responsible for the kidneys’ sensory and are located along the Nervus renalis - and end in the dorsal root ganglions T10-L3. The activity of sympathetic nerves can be increased over the switch in the central nervous system. As afferent neurons of different organs and body regions are very similar to each other (Benchetrit S et al, 2003), chemical stimulation of afferent neurons in the kidney is possible (Cesare P & McNaughton P, 1996). In pathologic changes caused by inflammation and sclerosis, a multitude of substances like protons and Bradykinin appear which can activate the sensory afferents (Reeh PW & Kress M, 2001). The aim of this work was to examine acid-induced currents in chemically stimulated renal afferents. The influence of Bradykinin on the sensibility of the nerve fibers to protons was also investigated. The research presented here focused on the following questions: 1. Do renal and non-renal afferents of cultivated dorsal root ganglions exhibit differences with regard to acid-stimulation? 2. Can an augmented concentration of Bradykinin lead to an increased sensibility of cultivated neurons with renal axon to proton concentration. 2. Methods 3-6 week old male sprague-dawley-rats (120-350g) were anesthetized and both kidneys were dye-loaded by subcapsular injection of the fluorescent 1,1'-Dioleyl-3,3,3',3',-tetramethylindocarbo-cyaninmethansulfonat (DiI), from Molecular Probes, Oregon. The dye was allowed to retrogradely diffuse over 5-7 days to the somata of the renal primary afferents in DRGs T12- L2. After this time ganglia were excised and dissociated and the single neurons were grown in cell cultures. The acid stimulation of neurons was investigated by whole-cell patch-clamp measurements. Acid stimuli of ph5 and ph6 were used. The sensitizing effect of the inflammatory mediator Bradykinin was investigated by pre-administration of the drug to the cells. 3. Results Dorsal root ganglions showed acid-induced transient as well as sustained currents at ph6 and ph5. The transient part of the response depended on ASICs and was seen to be inhibited by Amiloride. The sustained part of the response was dependent on vanilloid VR1 receptors as was inferred from experiments in vR1 knock-out mice and in rats using the VR1 receptor antagonist Capsazepine and Ruthenium red. The decrease of ph6 to ph5 caused an increase in the sustained currents, but the transient currents did not show any such changes. Interesting is that renal DRG neurons exhibited significantly higher amplitudes of acid induced transient currents than non-renal cells. Bradykinin increased the sustained currents at ph6, but not at ph5. 4. Conclusion Increased intra-renal proton concentration could stimulate renal afferent nerve fibers by well defined pharmacological mechanisms that are possibly influenced by pro-inflammatory substances like Bradykinin.
Abstract
- Hintergrund und Ziele Zu den bekanntesten Mechanismen für die Pathogenese der Hypertonie zählen eine vermehrte Wasser- und Natriumretention und eine übermäßige Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems. Aber auch eine erhöhte Aktivität des sympathischen Nervensystems, die in der Niere die tubuläre Natriumretention, die Reninausschüttung und den Nierengefäßwiderstand steigert, kann bei der Entstehung des Bluthochdrucks eine Rolle spielen (Grisk O & Rettig R, 2003). Signale werden von renalen sensorischen Rezeptoren aufgenommen und über afferente Nerven, die die Niere sensibel versorgen und entlang des Nervus renalis verlaufen, weitergeleitet und enden in den Hinterwurzelganglien Th10-L3. Durch die Umschaltung im zentralen Nervensystem kann die Sympathikusaktivität erhöht werden. Da sich Afferenzen in verschiedenen Organen und Körperregionen strukturell nicht wesentlich voneinander unterscheiden (Benchetrit S et al, 2003), scheint auch für die Niere eine Chemostimulation afferenter Fasern denkbar (Cesare P & McNaughton P, 1996). So können bei pathologischen Veränderungen durch Entzündungs- und Sklerosevorgänge eine Vielzahl von Substanzen, wie Protonen und Bradykinin, auftreten, die sensorische Afferenzen aktivieren können (Reeh PW & Kress M, 2001). Ziel der Arbeit war es, renale Afferenzen, die nach heutigem Kenntnisstand chemisch stimuliert werden, hinsichtlich säureinduzierter Ströme zu untersuchen. Außerdem sollte untersucht werden, ob Bradykinin die Empfindlichkeit der Nervenfasern auf Protonen verändern kann. Folgende Fragen standen dabei im Mittelpunkt der Forschung: 1. Unterscheiden sich renale und nicht-renale Afferenzen von kultivierten Hinterwurzelganglien hinsichtlich ihrer Reaktion auf Säurestimulation? 2. Führen steigende Konzentrationen von Bradykinin bei kultivierten Neuronen mit renalen Axonen zu einer steigenden Empfindlichkeit auf Protonenkonzentration? 2. Methoden 3-6 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten (120-350g) wurden anästhesiert und beide Nieren mit dem Fluoreszenzfarbstoff 1,1'-Dioleyl-3,3,3',3',-tetramethylindocarbo-cyaninmethansulfonat (DiI), von Molecular Probes, Oregon gelabelt. Das DiI wanderte innerhalb von 4-5 Tagen retrograd in die Somata der renalen Afferenzen der Hinterwurzelganglien Th11-L2. Danach wurden die Ganglien entnommen, das Gewebe dissoziiert und die einzelnen Neurone in Zellkultur gebracht. Mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik wurden die in Primärkultur gebrachten renalen Afferenzen hinsichtlich ihrer Säureantworten untersucht. Als Säurereiz wurde bei Ganzzellableitungen pH5 und pH6 verwendet. Außerdem wurde mit Bradykinin vorstimuliert, um zu untersuchen, ob sich die Säureempfindlichkeit der Nervenfasern auf Protonen dadurch verändert. 3. Ergebnisse und Beobachtungen Die Neurone zeigten nach Säurestimulation sowohl transiente als auch langanhaltende Ströme bei pH6 und pH5. Die transienten Antworten, die durch ASICs zustande kamen, konnten mit Amilorid signifikant geblockt werden. Die langanhaltenden Antworten entstanden durch den TRPV1-Rezeptor, der signifikant mit Capsazepin und Rutheniumrot geblockt werden konnte. Bei dem Abfall des pH-Wertes von 6 auf 5 vergrößerten sich die langanhaltenden Ströme, die transienten Ströme veränderten sich dagegen nicht. Interessant ist, dass renale Zellen signifikant stärkere Antworten auf den Säurereiz zeigten, als nicht-renale Zellen. Der Entzündungsmediator Bradykinin war in der Lage, den anhaltenden Strom bei pH6 zu verstärken, nicht dagegen bei pH5. 4. Praktische Schlussfolgerungen Zusammenfassend kann gesagt werden, dass renale afferente Nervenfasern, die zur krankheitsrelevanten Sympathikuserhöhung bei Hypertonie beitragen, empfindlicher auf einen Protonenanstieg, wie er beispielsweise bei entzündlichen Vorgängen in der Niere vorkommt, reagieren als nicht-renale Afferenzen. Der Entzündungsmediator Bradykinin kann dabei die langanhaltende Stromantwort bei pH6 verstärken.