Aufnahme, Metabolismus und Export von Arzneimitteln in der Leber: tripel- und quadrupeltransfizierte Zelllinien zur Analyse funktioneller Interaktionen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-09-10
Issue Year
2012
Authors
Fahrmayr, Christina
Editor
Abstract

It is commonly accepted that metabolizing enzymes play an important role for the pharmacokinetics of a prescribed drug substrate. A few years ago it was still assumed that only the physicochemical characteristics of a drug (e.g. lipophilicity) are decisive for its membrane permeability. However, it has been recognized over the recent years that transport proteins located in plasma membranes mediate the uptake of drugs into and their efflux out of cells thus affecting absorption, distribution and elimination of a given drug substrate. Due to the localization of these transport proteins in the basolateral (facing the basal lamina) and in the apical (facing the luminal surface) membrane of polarized cells a directed transport of drug substrates occurs through this physiological barrier. The directed transport of a drug can be investigated in vitro using cell lines simultaneously expressing uptake and efflux transporters. However, in vivo the coordinate function of transport proteins and metabolizing enzymes is a crucial determinant for the pharmacokinetics of a given drug. Therefore, the first part of this thesis was to investigate if it is possible to establish a triple-transfected MDCKII cell line with the simultaneous expression of the basolateral localized uptake transporter OATP1B1 (Organic Anion Transporting Polypeptide 1B1), the phase II enzyme UGT1A1 (UDP-Glucuronosyltransferase 1A1) and the canalicular localized efflux transporter MRP2 (Multidrug Resistance Protein 2). The functionality of the established cell line was investigated using the cholesterol-lowering drug ezetimibe and the anticancer agent etoposide in transcellular transport assays. A contribution of UGT1A1 to the glucuronidation of both drugs has already been described as well as an interaction of ezetimibe with the uptake transporter OATP1B1. In contrast, the uptake of etoposide via hepatic OATPs has not been investigated so far and a possible MRP2-mediated elimination of both drug glucuronides has not been proven directly in a suitable in vitro cell model. Transcellular transport studies revealed that ezetimibe itself is a rather poor substrate of MRP2, whereas ezetimibe glucuronide could be identified as substrate of this efflux transporter. Using single-transfected HEK293 cells etoposide was firstly tested as substrate of OATP1B1 in uptake experiments. Furthermore, transcellular transport experiments confirmed that etoposide itself is a substrate of MRP2. If also etoposide glucuronide is transported into the apical compartment of the triple-transfected cell line, has to be investigated in further transport experiments. To enable the investigation of all four phases (uptake, phase I metabolism, phase II metabolism and export) during the hepatic elimination of a drug, the triple-transfected cell line has been extended by the cytochrome P450 enzyme CYP3A4. The functionality of the newly established quadruple-transfected cell line was investigated in transcellular transport experiments using bosentan, a dual endothelin receptor antagonist, as substrate. The hepatic uptake of bosentan via OATP1B1 and its subsequent metabolism via CYP3A4 and CYP2C9 to three phase I metabolites (hydroxy-, phenol-, hydroxyphenol-metabolite) have been elucidated already. Direct glucuronidation of bosentan and phase I metabolites has previously been shown in human hepatocytes. However, the UGT isoform mediating these processes and the relevant efflux transporter(s) for the export of formed metabolites and/or parent compound could not be identified so far. Transcellular transport experiments with radiolabeled bosentan revealed that bosentan itself is a substrate of MRP2 in vitro. In intracellular compartments of UGT1A1-expressing cell lines and in apical compartments of UGT1A1-MRP2-expressing cell lines small amounts of a direct bosentan glucuronide could be detected. Furthermore, also small intracellular amounts of the hydroxy- and the phenol-metabolites were found in CYP3A4-expressing cell lines. Glucuronides of the phase I metabolites could not be detected in these experiments possibly due to a rather poor formation of phase I metabolites. Further investigations are necessary to clarify, whether altered experimental conditions may improve the formation of phase I- and possibly also of phase II metabolites and if an increased MRP2-mediated transport of these metabolites can be detected then or if other UGT isoforms and efflux transporters are also involved in the biliary elimination of bosentan and formed metabolites. Taken together, the establishment and characterization of functional active, multiple-transfected cell lines with the simultaneous expression of transport proteins and metabolizing enzymes has been successful. Furthermore, it could be shown that these multiple-transfected cell lines besides other in vitro systems, animal models and clinical studies can decisively contribute to a better understanding of the pharmacokinetics of drugs in the future.

Abstract

Während die Bedeutung metabolisierender Enzyme für die Pharmakokinetik eines Arzneistoffs bereits klar belegt war, vertrat man noch bis vor wenigen Jahren die Meinung, dass Arzneistoffe v.a. durch passive Diffusion Membranbarrieren überwinden. Inzwischen wurde gezeigt, dass Transportproteine in Plasmamembranen die Aufnahme eines Arzneistoffs in eine Zelle sowie seine Sekretion aus der Zelle vermitteln und somit von Bedeutung für die Resorption, Verteilung und Elimination eines Arzneistoffs sind. Die Lokalisation von Aufnahmetransportern in der basolateralen Membran (die der Basallamina zugewandte Seite) sowie von Effluxtransportern in der apikalen Membran (die einem Lumen zugewandte Seite) einer polarisierten Zelle ermöglicht zudem einen gerichteten Stofftransport durch diese physiologische Barriere. Mit entsprechenden Zellsystemen, welche sowohl Aufnahme- als auch Effluxtransporter exprimieren, ist es möglich, diesen gerichteten Stofftransport in vitro zu untersuchen. Ohne Beachtung blieb dabei bislang die Untersuchung des Zusammenspiels von Transportproteinen mit metabolisierenden Enzymen. In vivo sind aber häufig beide Vorgänge für die Pharmakokinetik eines Arzneistoffs von Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher zunächst eine tripeltransfizierte MDCKII-Zelllinie mit der Expression des hepatischen Aufnahmetransporters OATP1B1 (Organic Anion Transporting Polypeptide 1B1), des Phase-II-Enzyms UGT1A1 (UDP-Glucuronosyltransferase 1A1) sowie des in der kanalikulären Membran lokalisierten Effluxtransporters MRP2 (Multidrug Resistance Protein 2) etabliert und charakterisiert. Zur Überprüfung der Funktionalität der Zelllinie dienten der Cholesterolsenker Ezetimib und das Zytostatikum Etoposid. Bislang konnte für beide Arzneistoffe eine Beteiligung von UGT1A1 an ihrer Glucuronidierung und für Ezetimib eine Interaktion mit dem Aufnahmetransporter OATP1B1 nachgewiesen werden. Eine Aufnahme von Etoposid mittels hepatischer OATPs war bislang unbekannt und ein MRP2-vermittelter Export beider Arzneistoff-Glucuronide wurde noch nicht abschließend an einem geeigneten in vitro-Modell nachgewiesen. Mittels transzellulärer Transportversuche konnte gezeigt werden, dass Ezetimib selbst eher ein schlechtes Substrat von MRP2 darstellt, wohingegen Ezetimib-Glucuronid als Substrat von MRP2 identifiziert werden konnte. Weiterhin konnte Etoposid in Aufnahmeversuchen als Substrat von OATP1B1 identifiziert werden. Mittels transzellulärer Transportversuche wurde Etoposid außerdem als Substrat von MRP2 bestätigt. Ob auch Etoposid-Glucuronid ein Substrat von MRP2 ist, muss in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Als Weiterführung sollte getestet werden, ob es mit einem entsprechenden quadrupel-transfizierten Zellmodell möglich ist, alle vier Phasen (Aufnahme, Phase-I-Metabolisierung, Phase-II-Metabolisierung und Export) der hepatischen Elimination eines Arzneistoffs in vitro untersuchen zu können. Hierfür wurde das etablierte tripeltransfizierte Zellmodell um ein Phase-I-Enzym aus der Superfamilie der Cytochrom-P450-Enzyme (CYP3A4) erweitert. Mittels transzellulärer Transportversuche wurde die Funktionalität der neu etablierten Zelllinie untersucht. Als Substrat diente dafür der Endothelinrezeptor-Antagonist Bosentan, dessen Phase-II-Metabolismus und hepatische Sekretion bisher nur unzureichend aufgeklärt ist. Die hepatische Aufnahme von Bosentan mittels OATP1B1 sowie die Metabolisierung von Bosentan zu drei Phase-I-Metaboliten (Hydroxy-, Phenol-, Hydroxyphenol-Metabolit) mittels CYP3A4 und CYP2C9 sind hingegen hinreichend untersucht. Die Versuche ergaben, dass Bosentan in vitro selbst ein Substrat des Effluxtransporters MRP2 ist. Mittels Strukturaufklärungsanalysen konnte des Weiteren ein direktes Glucuronid von Bosentan in den intrazellulären Kompartimenten der UGT1A1-exprimierenden Zelllinien und in den apikalen Kompartimenten der UGT1A1-MRP2-exprimierenden Zelllinien nachgewiesen werden. Weiterhin wurden geringe intrazelluläre Mengen der Hydroxy- und Phenol-Metaboliten von Bosentan in CYP3A4-exprimierenden Zelllinien detektiert. Glucuronide der Phase-I-Metaboliten konnten im Rahmen dieser Untersuchungen nicht nachgewiesen werden. Weiterführende Untersuchungen müssen klären, ob Änderungen an den Versuchsbedingungen zu einer vermehrten Bildung von Phase-I- und Phase-II-Metaboliten führen und ob dann auch ein vermehrter MRP2-vermittelter Transport dieser Metaboliten detektierbar ist oder ob auch andere UGT-Isoformen und Effluxtransporter an der biliären Elimination von Bosentan beteiligt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Etablierung und Charakterisierung von funktionellen, mehrfachtransfizierten Zellsystemen mit der Expression von Transportproteinen und metabolisierenden Enzymen technisch möglich ist und dass diese Zellsysteme, neben anderen in vitro-Modellen, Tiermodellen und klinischen Studien in Zukunft einen Beitrag zum besseren Verständnis der Pharmakokinetik eines Arzneistoffs liefern können.

DOI
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