Backround: Epilepsies are severe neurological seizure disorders. A common form in adults is temporal lobe epilepsy (TLE). Various studies have documented long-term molecular and structural remodeling processes in the human brain of affected patients, i.e. studying the neurosurgically resected human hippocampus, and which were considered responsible for the chronic progressive course of the disease. In 2018, our group developed a reductionist cell culture model for the manifestation and progression of chronic temporal lobe seizures using a single glutamate-induced neuronal mass discharge which transforms the cell culture into a repetitively firing synchronous seizure network, i.e., “epilepsy-in-a-dish”. With this model, we were able for the first time to study the timeline of intervening molecular and/or structural changes at the neuronal cell level. We hypothesized, that epigenetic regulatory mechanisms, e.g. histone acetylation and DNA methylation, play a major role for the cellular memory of epileptogenesis. We further hypothesized, that neuronal reorganization such as altered axonal sprouting or abnormal synaptic connectivity represent the structural basis for the long-term seizure activity. The present work aimed, therefore, to quantitatively investigate structural remodeling processes in this cell culture model, i.e., dendritic sprouting with or without new synapse formation, thus helping to identify key mechanisms of experimental epileptogenesis in our cell culture model. Methods: For this purpose, hippocampal neurons from newborn rats were enriched in a cell culture and followed up over a period of three weeks. After 12 days, selected test cultures were treated with 10μM glutamate for 10 minutes and the changing neuronal discharge behavior was followed up using calcium imaging over a period of three to seven days. After calcium imaging, cultures were then fixed with 4% paraformaldehyde before being prepared for further immunofluorescence staining. For this, cells were blocked with Fish Skin Buffer + 0.1% Triton (FSB + T). Thereafter, cultures were incubated for Sholl anlayses with MAP2 and GFAP primary antibodies, or for synapse enumeration with Vesicular Glutamate Transporter 1 (VGLUT1), Vesicular GABA Transporter (VGAT), Bassoon primary antibodies before Alexa Fluo secondary antibodies were added for detection. Sholl analyses were performed after recording cells with fluorescence microscopy using a Fiji plugin (version 1.51s) and plotted in one graph per time point. Counting of synapses was performed manually, double-blind after recording cultures using confocal microscopy (135x135μm² recording area). Results: As expected from previous results, the single glutamate treatment did not induce significant neuronal cell death. However, after 7 days the neurons elicited spontaneous, synchronous and recurrent mass depolarizations typical for this model. Using multi-layered immunohistochemical staining techniques and a quantitative Sholl analysis, we observed a statistically significant increase in the dendritic arborisation of glutamate-treated compared to -untreated neurons in culture. In addition, the relative number of excitatory VGLUT1-immunopositive synapses increased over time in treated cell cultures. Discussion: An imbalance of inhibitory and excitatory synaptic signals has long been considered an essential feature of epileptic networks. Also, a proliferation of dendrites in the hippocampus of epilepsy patients has been documented since 1999 as a major structural feature of chronic and drug-resistant seizures. We now have a cell culture model at hand in which we can molecularly describe the individual phases of epileptogenesis and quantitatively document their effect on the morphology of affected neurons and their networks. With this model, it may be possible in the future to test interventionist procedures for the treatment and modification of the chronic-progressive course of the disease in a targeted manner without the use of complex animal models.

Hintergrund: Epilepsien gehören zu den häufigsten schweren neurologischen Erkrankungen. Eine gewichtige Epilepsieform bei Erwachsenen ist dabei die Schläfenlappenepilepsie (TLE). Hierbei konnten verschiedene Studien langfristige molekulare und strukturelle Umbauvorgänge im neurochirurgisch reseziertem Gehirngewebe des Hippocampus dokumentieren, welche für den chronisch progressiven Verlauf der Erkrankung maßgeblich verantwortlich zeichnen. Unsere Arbeitsgruppe hat 2018 ein reduktionistisches Zellkulturmodell für die Enstehung von chronischen Temporallappenanfällen entwickelt. Mit diesem Modell konnten wir erstmals eine Zeitachse von eingreifenden molekularen Veränderungen auf der Ebene einzelner Nervenzellen erstellen. Für dieses „zelluläre Gedächtnis der Epileptogenese“ spielen vor allem epigenetische Regulationsmechanismen eine Rolle, z.B. Histon-Acetylierungen und DNA-Methylierungen. So transformiert eine einzelne spontane Glutamat-induzierte neuronale Massenentladung die Zellkultur in ein repetitiv feuerndes, synchrones Anfallsnetzwerk. In der hier vorliegenden Arbeit sollte nun untersucht werden, inwiefern auch strukturelle Umbauvorgänge an den Nervenzellen selbst stattfinden und somit den Mechanismus der Epileptogenese verstetigen, z.B. in Form einer dendritischen Aussprossung mit oder ohne Neubildung von Synapsen. Methodik: Dafür wurden hippocampale Nervenzellen von neugeborenen Ratten in einer Zellkultur angereichert und über einen Zeitraum von drei Wochen nachbeobachtet. Nach 12 Tagen wurden ausgewählte Testkulturen für 10 Minuten mit 10μM Glutamat behandelt und das sich verändernde neuronale Entladungsverhalten mithilfe von Calcium-Imaging über einen Zeitraum von drei bis sieben Tagen nachbeobachtet. Nach dem Calcium-Imaging wurden die Kulturen mit 4%igem Paraformaldehyd fixiert. Vor der mikroskopischen Untersuchung mittels Immunfloureszenz-Färbungen wurden die Zellen mit Fish-Skin-Buffer + 0,1% Triton (FSB + T) gesättigt. Danach wurden die Kulturen für die Sholl-Anlaysen mit Primärantikörpern gegen MAP2- und GFAP-Epitope, bzw. für die Synapsenauszählung mit Vesiculärer Glutamat Transporter 1 (VGLUT1), Vesiculärer GABA Transporter (VGAT), Bassoon Primärantikörpern inkubiert, und mit Fluoreszenz-markierten Sekundärantikörpern sichtbar gemacht. Die Sholl-Analysen wurden nach Aufnahme der Zellen mit Floureszenzmikroskopie mittels eines Fiji Plugins (Version 1.51s) durchgeführt und in jeweils einen Graphen pro Zeitpunkt aufgetragen. Die Auszählung der Synapsen wurde nach der Aufnahme der Kulturen mittels konfokaler Mikroskopie (135x135μm² Aufnahmefläche) manuell, doppelblind ausgezählt. Ergebnisse: Wie aus unseren Vorergebnissen zu erwarten löste die einmalige Glutamatbehandlung keinen signifikanten Zelltod aus. Allerdings zeigten die Nervenzellen wiederum die für dieses Modell typische Entstehung rhythmisch-synchroner Massenentladungen, welche dem EEG-Befund betroffener Patienten sehr ähnlich sind. Mit Hilfe von immunhistochemischen Einzelzellfärbungen konnten wir mit Hilfe der Scholl-Analyse eine statistisch signifikante Vermehrung dendritischer Fortsätze in Nervenzellen behandelter im Vergleich zu unbehandelten Zellkulturen beobachten. Auch nahm die relative Anzahl exzitatorischer glutamaterger Synapsen in den behandelten Zellkulturen mit der Zeit zu. Diskussion: Ein Ungleichgewicht hemmender und erregender synaptischer Signale wird seit langem als wesentliches Merkmal für epileptische Netzwerke angesehen. Auch ist eine Vermehrung von Dendriten im Hippocampus von Epilepsiepatienten bereits seit 1999 als wesentliches strukturelles Merkmal chronischer und Medikamenten-resistenter Anfälle dokumentiert. Wir haben nun ein Zellkulturmodell zur Hand, in welchem wir die einzelnen Phasen der Epileptogenese molekular beschreiben und deren Auswirkung auf die Morphologie betroffener Nervenzellen und deren Netzwerke quantitativ dokumentieren können. Mit diesem Modell könnte es zukünftig möglich sein, ohne Einsatz von komplexen Tiermodellen interventionistische Verfahren zur Behandlung und Modifizierung des chronisch-progressiven Erkrankungsverlaufes gezielt zu testen.