Bestimmung der Oberflächenmarker und des Aktivierungsgrades von CD14+ Zellen aus humanem Blut nach Stimulation und Reifung mit IL-4/GM-CSF oder IL-15/GM-CSF
Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2015-03-04
Issue Year
2015
Authors
Pfeiffer, Hella
Editor
Abstract
- Background and objectives Coeliac disease is an autoimmune disorder which manifests itself in a localized inflammatory process of the mucosa in the small intestine. A characteristic feature is the known trigger (gluten), which can be added to or eliminated from the diet. In this thesis the expressions of certain surface molecules on dendritic cells and macrophages were studied. The cells of coeliac disease patients and healthy controls were compared.
- Material and methods The blood samples of 20 probands were evaluated: ten healthy controls (five HLA-DQ2/8-negative and five HLA-DQ2/8-positive), five coeliac disease patients on a gluten-free diet and five 'active` coeliac disease patients on a gluten-containing diet. From the probands blood the peripheral mononuclear cells were isolated through a Ficoll density gradient. These were further separated by magnetic cell sorting; the CD14+ cells were planted in cell cultures and measured by fluorescence associated cell sorting after one week. The CD14+ cells were frozen and later used as effector cells in a lymphocyte reaction. All probands were typed for HLA-DQ2/8 and checked for anti-transglutaminase-antibodies (IgA/IgG).
- Results The presence of HLA-DQ2/8 only had a minor effect on the stimulation of cells with IL-4 or IL-15 as well as on the further stimulation with tTG or T-gliadin. The degree of activity of the coeliac disease also had only a small impact on the stimulated cells. In contrast, the cytokine environment seemed to have a pronounced effect. The stimulation with tTG had a positive effect on CD25änd CD89 and a negative effect on CD209. The incubation with T-gliadin, especially in IL-15-derived macrophages, lead to a marked rise in the expression of CD25, CD71, CD89, CD103 as well as tTG. High levels of IL-15 (as shown in the intestinal mucosa of coeliac disease patients) combined with an elevated expression of CD25 seem to favor the heightened stimulation of the immune system.
- Conclusions This thesis showed that in a special cytokine environment as seen in coeliac disease patients (high levels of IL-15) gliadin fragments cause a distinct stimulation of the immune system. An elevated expression of both the activation marker CD25 as well as surface tissue transglutaminase was found, which could lead to a more efficient phagocytosis and, respectively, to a preferred presentation of deamidated, immunostimulatory gliadin fragments. Elevated levels of CD71 facilitate the passage of gliadin fragments through the epithelium. High levels of CD89 lead to a more efficient presentation of antigens. High levels of CD103 enable the immune cells to return to the intestinal epithelium. Taken together, these changes in the expression of CD-molecules lead to a marked modulation of the immune system. The inhibition of IL-15 could prove to be a therapeutic target in coeliac disease.
Abstract
- Hintergrund und Ziele Die Zöliakie ist eine Autoimmunerkrankung, welche sich vorwiegend in einer lokalen Entzündungsreaktion der Dünndarmschleimhaut zeigt. Das auslösende Agens (Gluten) ist bekannt und kann nach Belieben der Ernährung hinzugefügt oder weggelassen werden. In dieser Arbeit wurde die Oberflächenexpression von dendritischen Zellen und Makrophagen in Abhängigkeit vom Stimulans untersucht, wobei die Zellen von Zöliakiepatienten und gesunden Kontrollpersonen verglichen wurden.
- Methoden Ausgewertet wurde das Blut von 20 Probanden: zehn Kontrollen (jeweils fünf HLA-DQ2/8-negative und fünf HLA-DQ2/8-positive), fünf Zöliakiepatienten unter glutenfreier Diät und fünf 'aktive` Zöliakiepatienten, die sich glutenhaltig ernährten. Aus dem Blut der Probanden wurden mit Hilfe eines Ficoll-Dichtegradienten die peripheren mononukleären Zellen isoliert. Diese wurden über magnetmarkierte Partikel weiter aufgetrennt; die CD14+ Zellen wurden in einer Zellkultur ausgesät und nach einer Woche per Durchflusszytometrie vermessen. Die CD14+. Zellen wurden tiefgefroren und später als Effektorzellen im Lymphozytenproliferationstest eingesetzt. Bei allen Probanden wurden der HLA-DQ2/8-Trägerstatus sowie eventuell vorhandene anti-Transglutaminase-Antikörper (IgA/IgG) bestimmt.
- Ergebnisse und Beobachtungen Der HLA-DQ2/8-Trägerstatus hatte nur geringe Bedeutung bezüglich der Stimulierbarkeit von IL-4- oder IL-15-gereiften Zellen und deren weitere Stimulation durch TG2 oder T-Gliadin. Auch der Aktivitätsgrad der Zöliakieerkrankung hatte nur einen geringen Einfluss auf die Stimulierbarkeit der eingesetzten Zellen. Von größerer Bedeutung schien eher das Zytokinmilieu zu sein. Eine Stimulation mit TG2 wirkte sich auf die Moleküle CD25 und CD89 positiv, auf CD209 negativ aus. Die Inkubation mit T-Gliadin führte vor allem bei den IL-15-gereiften Makrophagen zu einer ausgeprägten Hochregulation, besonders bei CD25, CD71, CD89, CD103 und TG2. Die Kombination aus erhöhter IL-15-Konzentration im intestinalen Gewebe von Zöliakiepatienten mit einer erhöhten CD25-Expression scheint zu einer vermehrten Immunstimulation zu führen.
- Praktische Schlussfolgerungen In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in einem Zytokinmilieu, wie es bei Zöliakiepatienten auftritt (erhöhte IL-15-Konzentration), Gliadinfragmente eine deutliche Immunstimulation bewirken. Neben der vermehrten Expression des Aktivitätsmarkers CD25 wurde auch eine deutlich höhere Expression der Oberflächentransglutaminase 2 gefunden, was zu einer effizienteren Phagozytose bzw. Bereitstellung von deamidierten, immunstimulatorischen Gliadinpeptiden führen könnte. Erhöhte CD71-Werte können einen vermehrten Durchtritt von Gliadinfragmenten durch das Epithel fördern, CD89 eine effizientere Antigenpräsentation. Hohe CD103-Marker erleichtern die migratorische Rückkehr der Immunzellen in das Darmepithel. Gemeinsam führen diese Moleküle zu einer stärkeren Immunmodulation. Möglicherweise stellt die Blockade von IL-15 einen therapeutischen Ansatzpunkt bei Zöliakie dar.