Two-pore channels (TPCs) constitute a family of cation channels in plants and animals and are found in the membrane of the lytic vacuole and of endolysosomes, respectively. The channels are active as dimers, with one monomer consisting of two subdomains with six transmembrane domains each. The subdomains of one monomer are connected by a linker domain that, together with the N- and the C-terminus, faces the cytosol. This thesis further elucidates the molecular characteristics of two-pore channels regarding their targeting, regulation, and function. This was done with a focus on the Arabidopsis thaliana two-pore channel TPC1, and also mammalian TPCs were taken into consideration. For the analysis of the role of distinct channel domains a mutational approach was used, followed by transient expression of the resulting GFP-fusion proteins in Arabidopsis mesophyll protoplasts of the TPC1 loss-of-function mutant tpc1-2. The subcellular localization and the activity of different truncation and point mutants were investigated with confocal fluorescence microscopy and patch clamp measurements, respectively. It could be shown that for the correct assembly and trafficking of the channels the presence of all transmembrane domains was necessary. Furthermore, within the N-terminal region of AtTPC1 a dileucine motif (EDPLI) was essential for the targeting to the vacuolar membrane and a highly conserved, putatively α-helical structure (KAAAL-domain) was required for the correct trafficking and function of the channel. The dileucine motif mediated targeting process was not dependent on adaptor protein complexes 3 and 4, and a deletion or mutation of this conserved sorting motif redirected the channel to the plasma membrane. Expression of mouse TPC1 and TPC2 in plant cells resulted in a subcellular localization that mimicked their innate localization in endosomes and lysosomes of animal cells. Thus MmTPC1 was located at endosomal compartments and MmTPC2 at the vacuolar membrane in mesophyll cells, showing a conservation of the targeting processes and machineries throughout the different kingdoms. The C-terminal domain of AtTPC1 was shown to be essential for channel function since truncation of this domain left the channel inactive although the mutant was correctly localized. Dimerization of this C-terminal part, as shown by bimolecular fluorescence complementation and co-immunoprecipitation, and in particular the presence of an intrinsic predicted α-helix were essential for the gating of the channel. Deletions or mutations that led to a disruption of the predicted helical domain compromised channel activity, while the overall voltage-dependent properties were comparable to the wild type. Furthermore, bimolecular fluorescence complementation and co-immunoprecipitation results showed an interaction of TPC1 with the 14-3-3 protein GRF6 and of the TPC1 C-terminus with the kinase CIPK1, respectively. Plant TPC1 channels are activated in a voltage- and calcium-dependent manner, while the activation mode of animal TPCs is under debate. Two putative animal TPC activators, nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) and the phosphoinositide PI(3,5)P2, were tested in patch clamp measurements for their effect on AtTPC1. Neither of the two substances influenced AtTPC1.

Zwei-Poren Kanäle (two-pore channels, TPCs) bilden eine Familie von Kationenkanälen, die in Pflanzen und Tieren in der Membran der lytischen Vakuole, bzw. der Endolysosomen lokalisiert sind. Die Kanäle sind aktiv als Dimere, wobei ein Monomer aus zwei Untereinheiten mit je sechs Transmembrandomänen besteht. Die beiden Untereinheiten eines Monomers sind durch einen Linker verbunden, der zusammen mit dem N- und dem C-Terminus im Cytosol liegt. Diese Arbeit untersucht die molekularen Eigenschaften von TPCs bezüglich ihres Targetings, ihrer Regulierung und ihrer Funktion. Dies wurde schwerpunktmäßig für den Arabidopsis thaliana Zwei-Poren Kanal TPC1 untersucht, weiterhin wurden auch TPCs, die aus Säugetieren stammen, berücksichtigt. Zur Analyse der Rolle der unterschiedlichen Kanal-Domänen wurde eine Mutagenesestudie, gefolgt von transienter Expression der erhaltenen GFP-Fusionsproteine in Arabidopsis Mesophyll-Protoplasten der TPC1 Kanal-Verlustmutante tpc1-2, durchgeführt. Die subzelluläre Lokalisation und die Aktivität der verschiedenen Deletions- und Punktmutanten wurden mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Messungen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass für das korrekte Targeting und Trafficking der Kanäle alle Transmembrandomänen vorhanden sein mussten. Im N-terminalen Bereich von AtTPC1 wurde ein Dileucin-Motiv (EDPLI) identifiziert, welches notwendig für das Targeting zur Vakuolenmembran ist, sowie eine hochkonservierte, mutmaßlich α-helikale Struktur (KAAAL-Domäne), die wesentlich für das korrekte Trafficking und die Funktion des Kanals ist. Der Dileucin-Motiv vermittelte Targetingprozess war unabhängig von den Adapterprotein-Komplexen 3 und 4, und eine Deletion oder Mutation des konservierten Sorting-Motivs verursachte eine Umlenkung des Kanals zur Plasmamembran. Expression von Maus TPC1 und TPC2 in pflanzlichen Zellen führte zu einer subzellulären Lokalisation, die deren ursprünglicher Lokalisation in Endosomen und Lysosomen tierischer Zellen entspricht. So wurde MmTPC1 in endosomalen Kompartimenten und MmTPC2 in der Vakuolenmembran von Mesophyllzellen detektiert, was auf eine Konservierung der Targetingprozesse und -maschinerie in den verschiedenen Spezies hinweist. Die C-terminale Domäne von AtTPC1 wurde als maßgeblich für die Kanalfunktion identifiziert, da der Verlust dieser Domäne den Kanal inaktivierte, obwohl die Mutante richtig lokalisiert war. Die Dimerisierung des C-Terminus, wie durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation und Co-Immunpräzipitation gezeigt werden konnte, und insbesondere die Anwesenheit einer intrinsischen vorhergesagten α-Helix waren essentiell für das Gating des Kanals. Deletionen oder Mutationen, die zu einer Störung der vorhergesagten helikalen Struktur führten, verringerten die Kanalaktivität, obwohl die spannungsabhängigen Eigenschaften vergleichbar mit dem Wildtyp waren. Weiterhin konnte eine Interaktion von TPC1 mit dem 14-3-3 Protein GRF6 mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementation gezeigt werden, sowie eine Interaktion des TPC1 C-terminus mit der Kinase CIPK1 mittels Co-Immunpräzipitation. Pflanzliche TPC1-Kanäle aktivieren in einer spannungs- und Kalzium-abhängigen Art und Weise, während der Aktivierungsmodus von tierischen TPCs umstritten ist. Zwei putative Aktivatoren von tierischen TPCs, Nicotinsäureadenindinukleotidphosphat (NAADP) und das Phospholipid PI(3,5)P2, wurden in Patch-Clamp-Messungen auf ihre Wirkung auf AtTPC1 hin getestet, wobei keine der beiden Substanzen die Kanalaktivität beeinflusste.