This thesis comprises the enzyme purification as well as a molecular-biological isolation and characterization of malonyl-coenzyme A: 21-hydroxypregnane-21-hydroxy-malonyltransferases (21MaT) from Erysimum crepidifolium and Arabidopsis thaliana. Current knowledge suggests that the 21MaT initiates the specific step of the butenolide ring formation which is essential for cardenolide biosynthesis. To investigate the 21MaT enzyme activity the substrates 3β-O-acetyl-5β-pregnane-14β-21-diol-20-one and 3β-O-benzoyl-5β-pregnane-14β-21-diol-20-one were synthesized. For solving problems in the detection 21MaT reaction products 3-O-esterase and 21-O-esterase activities were analysed in E. crepidifolium, D. lanata und A. thaliana. A. thaliana 21MaT was purified applying a four step column purification protocol. The mass of the enzyme was 43,5 to 55,2 kDa. During the 21MaT purification the interferring 21-O-esterase activity was removed. Using a homology approach the PMaT1 gene from A. thaliana was isolated, cloned and expressed in E. coli. From the genome of E. crepidifolium the homologous gene, termed EcPMaT1 was isolated and cloned. The recombinant enzyme rAtPMaT1 accepted substrates with 21-hydroxypregnane-structure. Kinetic constants KM, kcat as well as the catalytical efficiency were determined for acetylketol, the presumed direct precursor of butenolide ring formation. Acetylketol was accepted about 10 times worse than the (putative physiological) anthocyanidine substrates. The 21MaT seems to belong to the group of promiscous enzymes, which probably enable steps or even pathways associated with specialized plant metabolism. In vivo investigations of AtPMaT1 using cardenolide precursors in A. thaliana should create further elementary knowledge on the cardenolide formation, storage and remetabolization. Moreover AtPMaT1 is a highly qualified candidate in a metabolic engineering project for creating cardenolides in yeast.

Die vorliegende Arbeit umfasst die Enzymreinigung und die molekularbiologische Isolierung und Charakterisierung einer Malonyl-Coenzym A: 21-Hydroxypregnan-21-Hydroxy-Malonyltransferase (21MaT) aus Erysimum crepidifolium und Arabidopsis thaliana. Es wird angenommen, dass die 21MaT die Butenolidringbildung initiiert und so für die Bildung von Cardenoliden essentiell ist. Zunächst wurden die 21MaT-Substrate 3β-O-Acetyl-5β-pregnan-14β-21-diol-20-on und 3β-O-Benzoyl-5β-pregnan-14β-21-diol-20-on synthetisiert. Um die Detektierbarkeit der 21MaT-Reaktionsprodukte zu gewährleisten, wurden 3-O-Esterasen und 21-O-Esterasen in den Pflanzen E. crepidifolium, D. lanata und A. thaliana vergleichend untersucht. Aus A. thaliana konnte über eine vierstufige säulenchromatographische Reinigung 21MaT angereichert werden. Das Enzym hat eine Masse von 43,5 bis 55,2 kDa. Die 21-O-Esteraseaktivität wurde im Zuge einer Aufreinigung von der 21MaT abgetrennt. Das Gen PMaT1 wurde mitteles eines Homologie-Ansatzes aus A. thaliana isoliert, kloniert, und in E. coli exprimiert. Aus dem Genom von E. crepidifolium wurde die homologe Nukleotidsequenz EcPMaT1 isoliert und kloniert. Das rekombinante Enzym rAtPMaT1 akzeptiert Substrate mit 21-Hydroxypregnan-Struktur. Mit Acetylketol als vermutetem Vorstufensubstrat der Butenolid-Ringbildung, wurden die kinetischen Konstanten KM, kcat sowie die katalytische Effizienz bestimmt. Acetylketol wird 10-mal schlechter als (die putativ physiologischen) Anthocyanidin-Substrate umgesetzt. Die 21MaT scheint zur Gruppe promisker Enzyme zu gehören, die möglicherweise Schritte oder sogar Stoffwechselwege im speziellen Pflanzenmetabolismus katalysieren könnte. In vivo-Untersuchungen der AtPMaT1 mit Cardenolid-Vorstufen könnten weitere elementare Erkenntnisse der Cardenolidbildung, Speicherung und Remetabolisierung vermitteln. Außerdem ist die AtPMaT1 eine geeignete Kandidatin eines Metabolic Engineering Projekst zur Bildung von Cardenoliden in der Hefe.