Dissoziation der NTPase und Helikase- Aktivitäten der Superfamilie II NTPase/Helikasen am Beispiel der Hepatitis C Virus NTPase/Helikase

Abstract

NTPase/Helikasen sind Nukleotidtriphosphat (NTP)-abhängige ubiquitäre Enzyme mit der Fähigkeit während der genomischen Replikation Doppelstrang RNA Strukturen enzymatisch zu entwinden. Trotz einiger kinetischer und funktioneller Experimente mit NTPase/Helikasen der Superfamilie II ist der Mechanismus, der über die ATP-Bindung und Hydrolyse zur RNA Entwicklung führt, noch wenig bekannt. Die Substraterkennung und Hydrolyse an der NTP-bindenden Tasche und besonders deren Assoziation mit der Entwindungsaktivität wurden am Beispiel der Hepatitis C Virus NTPase/Helikase funktionell näher untersucht. Hierzu wurden die drei Funktionen NTP-Bindung, NTPase und Helikase der NTPase/Helikase im Einzelnen charakterisiert und in unterschiedlichen Assays der Einfluß von Aktivatoren und Inhibitoren auf die Funktionsfähigkeit des Holoenzyms getestet und der jeweilige Inhibitionstyp näher bestimmt. Als Aktivatoren und Inhibitoren wurden Paclitaxel, Trifluoperazin, Ribavirin, Ribavirintriphosphat und Derivate von Chlorethylguaninen verwendet. Die NTPase/Helikase besteht aus drei Domänen, in der ersten Domäne ist das hoch konservierte NTP-bindende Motiv lokalisiert. Die ATP-bindende Domäne wurde durch limitierten proteolytischen Verdau eines größeren Fragmentes der NTPase/Helikase gewonnen, aufgereinigt, ansequenziert und als minimales ATP-bindendes Fragment durch Bindung mit einem Nukleosidanalogon verifiziert und anschließend charakterisiert. Ebenso wurden die NTPase und die Helikase der NTPase/Helikase aufgereinigt und enzymatisch charakterisiert. In kinetischen Studien wurde festgestellt, daß die Inhibition durch die Inhibitoren/ Aktivatoren an der NTP-bindenden Stelle nicht mit der Funktion der ATPase der NTPase/Helikase korrelierten und die Hypothese der Existenz einer zweiten Bindungsstelle in der NTPase/Helikase stützen würden. Beispielsweise bei Verwendung von Ribavirin im Testsystem zeigte sich bei höheren Konzentrationen von Ribavirin (>750 µM) und ATP (> Km) eine Aktivierung der NTPase der NTPase/Helikase. Die besetzte niedrig-affinere Bindungsstelle würde in dem Modell die Modulation der NTP-Utilisation an der 39 hoch-affinen Stelle modifizieren. Weiter ließ sich bei der Untersuchung der Kopplung der NTPase und der Helikase der NTPase/Helikase zeigen, daß die NTPase und die Entwindungstätigkeit der Helikase der NTPase/Helikase nicht direkt gekoppelt waren, bei Verwendung von O6-Benzylguaninen konnte die ATPase der NTPase/Helikase gehemmt werden, ohne daß die Helikase beeinflußt wurde. Vice versa ließ sich die Helikase-Aktivität durch Vewendung von N9-Chlorethylguaninen steigern, ohne daß die ATPase der NTPase/Helikase beeinflußt wurde. Dies wurde als Dissoziation der NTPase/Helikase beschrieben. So ließ sich folgern, daß auch die Kopplung der NTPase mit der Helikase der NTPase/Helikase ein zukünftiger Angriffspunkt gezielter antiviraler Therapie ist.