Human respiratory and enteric viruses: methods for diagnostics and discovery

Abstract

Virale Infektionen der Atemwege und des Magen-Darm-Traktes zählen zu den häufigsten menschlichen Krankheitsbildern. Sie stellen aufgrund von Prävalenz, Infektiosität und hoher Morbidität und Mortalität weltweit eines der gravierendsten Probleme des öffentlichen Gesundheitswesens dar. Bislang konnte nur ein geringer Teil des großen Spektrums viraler Erreger beschrieben werden. Neue molekularbiologische Methoden machten in den letzten Jahren die Entdeckung und Klassifizierung verschiedener bislang unbekannter Viren möglich, darunter auch Coronaviren und neue humanpathogene Parechoviren. Die Ziele dieser Arbeit waren: (1) die Prävalenz respiratorischer Viren und atypischer Bakterien bei deutschen Flugreisenden mit respiratorischer Symptomatik während der SARSEpidemie zu untersuchen; (2) einen universellen RT-PCR (reverse transcription, polymerase chain reaction) Test für Coronaviren zu entwickeln, verbunden mit einer Spezies-spezifischen Typisierung durch eine nicht-Fluoreszenz basierte low density DNA oligonucleotide microarray; (3) Die neu beschriebene VIDISCA (virus-discovery-cDNA-AFLP) Methode zur Entdeckung unbekannter Viren zu etablieren und bei nicht typisierbaren Isolaten aus Zellkulturen anzuwenden; (4) Den ersten real time RT-PCR Test für alle humanpathogenen Parechoviren (HPeV) zu entwickeln und deren Prävalenz bei Patienten mit dem klinischen Leitbild Diarrhö zu bestimmen; (5) Eine neuartige Methode zur Entdeckung von Viren mit einem (+)-RNA Einzelstrang Genom zu entwickeln (sog. GDD Methode), basierend auf der Inkorporation der nicht natürlich vorkommenden Nukleotide Iso-G und Iso-C in PCR Primern, unter Verwendung von Chikungunya Virus als Modellorganismus. In klinischen Proben von 172 Flugreisenden mit respiratorischer Symptomatik konnte in 67 Fällen (43,2%) ein Erreger identifiziert werden. Hierbei wiesen Influenza- und Parainfluenzaviren mit 14,2% und 15,5% die höchste Prävalenz auf. Die Prävalenz von Adenoviren, humanem Metapneumovirus, Coronaviren und Rhinoviren schwankte zwischen 2,6% und 4,8%. Humanes Bocavirus, Respiratory Syncytial Virus sowie Legionella, Mycoplasma und Chlamydophila Spezies konnten nicht oder nur in Einzelfällen (<1%) identifiziert werden. Die Studie lieferte hiermit die ersten verfügbaren Daten zur Prävalenz dieser Erreger bei respiratorischen Erkrankungen nach Flugreisen. Die universelle Coronavirus RT-PCR zeichnete sich durch hohe Sensitivität und Spezifität aus, die untere Nachweisgrenze lag bei 16 Viren pro Reaktion. Die klinische Nachweisgrenze bei Schweren Akuten Respiratorischen Syndroms (SARS)-Patienten lag bei rund 100 viralen Partikeln pro eingesandtem Probenmaterial. Die Sensitivität der universellen RT-PCR war identisch mit individuellen spezies-spezifischen real time RT-PCR Tests bei 46 Kindern, die mit humanen Coronaviren 229E, NL63, OC43 oder HKU1 infiziert waren. Die Identifizierung der jeweiligen Coronavirusspezies war in jedem der getesteten Isolate einheitlich und in voller Übereinstimmung mit den jeweiligen Coronavirus Prototypen und konnte auch durch Nukleotid-Sequenzierung bestätigt werden. Die Prävalenzstudie zu akuten Gastroenteritiden wurde anhand von 499 Patientenproben aller Altersstufen durchgeführt, welche im Zeitraum eines Jahres gesammelt wurden. Die HPeV Grundprävalenz lag bei 1,6%. Positive Proben entstammten nur aus den Jahreszeiten Sommer und Herbst. Mit einer Ausnahme waren alle positiven Patienten unter 2 Jahren alt, bei gleichmäßiger Verteilung auf beide Geschlechter. Bei Kindern unter 2 Jahren konnte eine 11,6% Prävalenz ermittelt werden. Die Mehrzahl der Isolate konnte als gegenwärtig zirkulierendes HPeV Typ 1 identifiziert werden. Zusätzlich konnte ein neues sechstes HPeV identifiziert und beschrieben werden. Die VIDISCA Methode lieferte ein 188 Nukleotid-Fragment aus regulär nicht typisierbarem Zellkulturmaterial, welches nach initialer Sequenzierung HPeV Typ1 zugeordnet werden konnte. Eine phylogenetische Analyse des Vollgenoms dieses Kulturvirus zeigte deutliche Abweichung vom 1961 erstbeschriebenen HPeV Typ1 Prototypen und insbesondere eine Rekombination zwischen HPeV Typ 1 und 3. Die GDD Methode konnte erfolgreich auf das Chikungunya Virus Modell angewendet werden. Es war möglich, Chikungunya Fragmente sowohl aus Vollgenom in vitro RNA Transkripten, als auch aus Zellkulturmaterial zu amplifizieren, klonieren und zu sequenzieren.

Viral respiratory and enteric infections are the most common illnesses in humans and a major public health problem worldwide due to their occurrence, ease of spread and considerable morbidity and mortality. They are caused by a large spectrum of different viruses but only a very small fraction of them has been determined. In the last years, novel viruses causing respiratory and enteric infections have been discovered, including new coronaviruses and human parechoviruses. The objectives of this study were: (1) investigate the spectrum of respiratory viruses and atypical bacteria in samples collected in Germany from air travellers with symptoms of respiratory infection during SARS epidemic; (2) develop a universal reverse transcription, polymerase chain reaction (RT-PCR) for the genus coronavirus combined with species identification by a non-fluorescent, low-density oligonucleotide array; (3) implement and use the Virus-Discovery-cDNA-AFLP (VIDISCA) method to identify untypeable viruses growing in cell culture; (4) develop the first broad-range real-time RT-PCR assay for all human parechoviruses and investigate their prevalence in patients with gastroenteritis; (5) establish a new method for discovery of viruses with single-stranded, positive strand RNA genomes (GDD method), employing the unnatural nucleotides isoC and isoG in PCR primers and using chikungunya virus as a model organism. In respiratory samples from 172 patients presenting symptoms of respiratory infection after air travel, a pathogen was identified in 67 travellers (43.2%). Influenza and parainfluenza viruses were most prevalent, at 14.2% and 15.5%, respectively. Prevalence of adenoviruses, human metapneumovirus, coronaviruses, and rhinoviruses ranged between 2.6% and 4.8%. Human bocavirus, respiratory syncytial virus, and Legionella, Mycoplasma, and Chlamydophila species were absent or appeared at frequencies of <1%. These were the first specific baseline data for the mentioned agents in the context of air travel. The universal coronavirus RT-PCR presented high specificity and sensitivity, detecting a minimum of 16 viruses per reaction test. The clinical detection limit in patients with severe acute respiratory syndrome was about 100 viruses per sample. In 46 children suffering from human coronaviruses 229E, NL63, OC43, or HKU1, the sensitivity was as high as that of individual real-time RT-PCR assays. Coronavirus identification by oligonucleotide array was uniform in all samples and prototypes tested, and in full concordance with nucleotide sequencing. The study of patients with gastroenteritis was conducted with samples collected during a period of one year and covered all age groups. The overall detection rate of human parechovirus infection was 1.6%. Positive samples occurred only in summer and autumn. All positive patients except one were <2 years of age, with a neutral gender ratio. In children <2 years of age, the detection rate was 11.6%. Phylogenetic analysis showed mainly contemporary human parechovirus type 1 strains. A novel human parechovirus type 6 could be identified and characterized. The VIDISCA method amplified a 188 nucleotide fragment from an untypeable virus growing in cell culture. Sequence analysis identified an HPeV type 1. Whole genome sequence analysis of this isolate revealed it as a divergent strain in relation to the prototype 1 described in 1961, as well as a genomic recombination between human parechovirus types 1 and 3. The GDD method was successfully established in the chikungunya model. Genome fragments from chikungunya virus could be obtained from a full-length in vitro transcript RNA, as well as from virus growing in cell culture. Genome fragments could be amplified, cloned and sequenced.