Untersuchungen zum Proteinabbau während der Differenzierung neuraler Stammzellen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde das Aktivitätsniveau unterschiedlicher Proteinabbauwege während der Differenzierung neuraler Stammzellen untersucht, sowie ihr jeweiliger Einfluss auf das Differenzierungsverhalten der Stammzellen. Praktische Grundlage dieser Fragestellung ist die Etablierung von Methoden, um in späteren Versuchen die Ursache der erhöhten Zellsterblichkeit bei der therapeutischen Transplantation neuraler Stammzellen auch im Tiermodell untersuchen zu können.

Im ersten Teil der Untersuchung wurden im Western Blot Verfahren verschiedene Markerproteine aus undifferenzierten und differenzierenden neuralen Stammzellen an den Differenzierungstagen 1,3 und 7 bestimmt. Es konnte im genannten zeitlichen Verlauf eine Herabregulation aller ER-Stress bzw. Zellstressmarker, sowie ein Anstieg des Autophagiemarkers LC3 und der Caspase 12-Aktivität beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in neuralen Stammzellen ein erhöhtes ER-Stress Niveau besteht, das mit zunehmender Differenzierung abnimmt. Es kann des Weiteren eine Induktion der Autophagie und der Apoptose während der Differenzierung innerhalb dieses Zeitraums angenommen werden, wobei die Apoptose aufgrund des zeitlich versetzten Auftretens zum ER-Stress vermutlich in keiner Beziehung zu diesem steht.

Zur Untersuchung des Ubiquitin-Proteasom-Systems wurden 2 unterschiedliche Methoden angewandt. In einem transgenen Mausmodell mit UBB+1 Gen, das zu einer Beeinträchtigung der Proteasomfunktion führt, konnte keine signifikante Veränderung der Neurogenese im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden. In einer Zellkulturuntersuchung mit pharmakologischer Beeinflussung von ER-Stress, UPS und Autophagie, ließ sich eine Veränderung der Neurogenese durch ER-Stress und Autophagie nachweisen. Während die Induktion von ER-Stress die Neurogenese anregte, hemmte eine Hemmung der Autophagie die Neurogenese. Die vorliegende Arbeit weist erstmals auf, wie Proteinabbauwege an der Differenzierung neuraler Stammzellen beteiligt sind und liefert somit einen Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen.

The subject of the work was to investigate the level of activation in different protein degradation pathways during the period of differentiation of neural stem cells, as well as to investigate the influence of these pathways on the differentiation of the stem cells. The practical basis of this examination was to establish methods in order to be able to examine the cause for apoptosis of stem cells following therapeutic transplantation focusing on degradative protein transport pathways.

In the first part, marker proteins of degradative protein transport pathways from undifferentiated and from differentiated neural stem cells at day 1, 3 and 7 of differentiation were quantified. During this period, a down regulation of all ER- and cell stress markers on the one hand as well as an increase of the autophagy marker LC 3 and of the activity of Caspase 12, on the other hand was observed. These findings suggest elevated ER-stress levels in neural stem cells, which decrease with ongoing differentiation. Furthermore, an induction of autophagy and apoptosis during differentiation is suggested.

In order to further examine these findings, two different methods were used. In a transgenic mouse model with impaired Ubiquitin-proteasome-system (UPS), a significantly reduced proliferation of neuronal progenitors did not translate into alterations in the number of neurons. In a cell culture approach, pharmacological alterations of ER-Stress, UPS, or autophagy showed that both ER-stress and autophagy influence neurogenesis. While induction of ER-stress stimulates neurogenesis, inhibition of autophagy hinders neurogenesis. The work describes for the first time how degradative protein transport pathways are involved in differentiation of neural stem cells and provides a valuable starting point for further examinations.