Untersuchung der Rolle von Rptpζ sowie von Rsk2 bei der molekularen Pathogenese des Osteosarkoms

Abstract

Das Osteosarkom (OS) – ein äußerst aggressiver primärer Knochentumor – zählt zu den häufigsten malignen soliden Tumoren im Kindes- und Jugendalter. Da sich die Prognose dieser Erkrankung in den letzten 30 Jahren kaum verbessert hat und nach wie vor trotz Therapie mehr als 30 % der Patienten versterben, ist die Identifizierung krankheitsspezifischer Zielmoleküle zur Entwicklung neuer Therapieansätze von zentraler Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle der Rezeptor-Proteintyrosinphosphatase Rptpζ sowie der Ribosomalen S6 Kinase Rsk2 bei der Pathogenese des Osteosarkoms untersucht werden. Wie durch Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt wurde, handelt es sich bei Rptpζ (kodiert von Ptprz1) um einen Marker terminal differenzierter Osteoblasten, der in vitro einen hemmenden Einfluss auf die Proliferation dieser Zellen hat. Es stellte sich demnach die Frage, ob Rptpζ auch in vivo als negativer Regulator der Osteoblastenproliferation fungiert und somit als Tumorsuppressor die Entstehung von Osteosarkomen verhindert. Daher wurden Ptprz1-defiziente Mäuse mit Tieren, die aufgrund einer heterozygoten Trp53-Deletion zur Tumorbildung neigen, verpaart und mittels Kontaktradiographie im Alter von 52 Wochen analysiert. Tatsächlich ließ sich in Abhängigkeit des Ptprz1-Genotyps die Bildung von Osteosarkomen nachweisen. Während keine der Trp53+/- Kontrolltiere skelettale Auffälligkeiten zeigten, konnten in 5 % der Trp53+/-/Ptprz1+/- sowie in 19 % der Trp53+/-/Ptprz1-/- Mäuse Knochentumoren identifiziert werden. Diese traten sowohl am Rippenbogen als auch an der Wirbelsäule und im Röhrenknochen auf. µCT- und histologische Analysen der Tumoren bestätigten das Vorliegen von Osteosarkomen und ermöglichten deren histologische Klassifizierung als „osteoblastisch“. Zudem erbrachte die Analyse von Zelllinien, die aus verschiedenen Osteosarkomen (Trp53+/-/Ptprz1+/- und Trp53+/-/Ptprz1-/-) etabliert worden waren, dass das osteogene Differenzierungspotential dieser Zellen auch ex vivo vorhanden war. Die putative Tumorsuppressorfunktion von Ptprz1 wurde weiterhin durch vergleichende Analysen beider OS-Zelllinien aufgezeigt. So konnte in den Ptprz1-defizienten Zellen eine signifikant höhere zelluläre Proliferationsrate sowie eine verstärkte Tyrosinphosphorylierung spezifischer intrazellulärer Substrate nachgewiesen werden. Weiterhin belegten Proliferationsanalysen in Anwesenheit des Rptpζ-Antagonisten Midkine (Mdk), dass durch dessen Zugabe ausschließlich die Proliferation der Ptprz1-heterozygoten Zelllinie gesteigert wurde. Dies implizierte, dass der proliferationsfördernde Effekt von Mdk auf die OS-Zelllinien von der Interaktion mit Rptpζ abhängt, was insofern relevant ist, als dass MDK im humanen Osteosarkom häufig überexprimiert wird. Bei Untersuchungen zur Rolle von Rptpζ im Osteosarkom des Menschen blieben Datensatzanalysen zur Identifizierung von Kopienzahlveränderungen oder etwaigen Mutationen im humanen PTPRZ1-Gen bislang erfolglos. Mittels Datenanalyse 17 Exom-sequenzierter humaner OS-Gewebe konnte zwar eine heterozygote Keimbahnmutation im PTPRZ1-Gen identifiziert werden, jedoch zeigten darauffolgende in vitro Untersuchungen, dass jene Mutation keine funktionelle Beeinträchtigung der antiproliferativen Aktivität des Rptpζ-Proteins zur Folge hatte. Nichtsdestotrotz handelt es sich bei Rptpζ um ein Membranprotein, das gewebespezifisch exprimiert wird. So könnte es als Zielmolekül für die Entwicklung von OS-Therapieansätzen dennoch von Bedeutung sein, z.B. durch eine gezielte Antagonisierung seiner Interaktion mit Mdk.

Für die Untersuchung der Rolle von Rsk2 bei der Tumorgenese des Osteosarkoms wurde ein anderes Mausmodell herangezogen – das c-fos-transgene Modell. Die Überexpression dieses Transkriptions-faktors führt in den Tieren zur Entwicklung von Osteosarkomen. Vorarbeiten zeigten, dass das Osteosarkom-Wachstum bei gleichzeitiger genetischer Inaktivierung von Rsk2 - einer Kinase, die in vitro die Stabilität von c-Fos moduliert - deutlich gestört ist. Es stellte sich daher die Frage, über welchen molekularen Mechanismus dieser protektive Effekt der Rsk2-Deletion vermittelt wird. Der von unserer Arbeitsgruppe postulierte Mechanismus ist die „Mitotische Katastrophe“. Erste Hinweise hierfür ergaben sich aus Genexpressionsanalysen, die eine erhöhte Expression von mitotischen Genen in Rsk2-defizienten c-fos-transgenen Osteosarkomen zeigten. Proliferations-, Immunfluoreszenz- und Zellzyklusanalysen von Zelllinien, die aus Tumoren c-fos-transgener Mäuse mit bzw. ohne Rsk2-Defizienz etabliert worden waren, erbrachten, dass die Abwesenheit der Kinase mit einem drastischen Proliferationsdefekt sowie mit dem vermehrten Auftreten multinukleärer polyploider Zellen assoziiert war. Zudem ließen sich in jenen Zellen atypische multipolare Mitosefiguren beobachten. Als wichtiger Aspekt dieser Arbeit sollte weiterhin ermittelt werden, ob jener Phänotyp ebenso durch eine pharmakologische Rsk2-Inhibition reproduziert werden kann. In der Tat bestätigten äquivalente in vitro Versuche mit c-fos-transgenen Zellen in Anwesenheit des Rsk-Inhibitors BI-D1870 die Ergebnisse der genetischen Rsk2-Inaktivierung. Der wachstumshemmende Effekt von BI-D1870 konnte weiterhin in der humanen OS-Zelllinie U2OS sowie in den o.g. Trp53-heterozygoten Zelllinien nachgewiesen werden. Zusammenfassend implizierten diese Daten, dass transformierte OS-Zellen in Folge einer Rsk2-Inaktivierung fehlerhafte Mitosen durchlaufen, die zur Bildung mehrkerniger Zellen mit einem von der Norm abweichenden DNA-Gehalt führen. Letztlich resultieren diese Defekte in einer verminderten Zellproliferation bzw. in der Apoptose. Die Induktion dieses als „mitotische Katastrophe“ bezeichneten onkosuppresiven Schutzmechanismus durch die gezielte Inhibition der Rsk2 Kinase stellt demnach einen vielversprechend Ansatz zur Eliminierung von OS-Tumorzellen dar.

Osteosarcoma (OS) – a highly aggressive primary bone tumor – belongs to the most common malignant solid tumors in childhood and adolescence. As the prognosis has not improved significantly over the last 30 years and more than 30 % of the treated patients still die of this disease, the identification of specific molecular targets for novel therapies is highly relevant. This thesis focused on the implication of the receptor protein tyrosine phosphatase Rptpζ and the ribosomal S6 Kinase Rsk2 in the pathogenesis of osteosarcoma. Our group previously identified Rptpζ (encoded by Ptprz1) as a marker of terminally differentiated osteoblasts which negatively regulates their proliferation in vitro. The question which has been addressed in this thesis is, whether Rptpζ can function as a tumor suppressor protein inhibiting OS development in vivo. We therefore crossed Ptprz1-deficient mice with tumor-prone Trp53-heterozygous mice and analyzed the skeletal phenotype by contact radiography at the age of 52 weeks. By screening a large number of mice we did detect OS development depending on the genotype of Ptprz1. While none of the Trp53+/- littermates displayed skeletal abnormalities, OS development was detected in 5 % of Trp53+/-/Ptprz1+/- and in 19 % of the Trp53+/-/Ptprz1-/- mice. The skeletal tumors were located in ribs, spine and long bones. μCT- and histological analyses confirmed the presence of osteosarcoma and allowed their histological subclassification as "osteoblastic OS". Additionally, cell lines derived from different tumors (Trp53+/-/Ptprz1+/- and Trp53+/-/Ptprz1-/-) were able to undergo osteogenic differentiation ex vivo. The putative tumor suppressor function of Ptprz1 was further demonstrated by a comparison of the two OS cell lines. Importantly, Ptprz1-deficient cells displayed a significant increase in proliferation together with a higher abundance of tyrosine-phosphorylated substrates. Further analyses revealed that Midkine (Mdk), an antagonist of Rptpζ, exclusively enhanced the proliferation of the Ptprz1 heterozygous cell line. This implied that the pro-proliferative influence of Mdk on the OS cell lines depends on Rptpζ interaction, which is potentially relevant, as MDK is over-expressed in human OS. To address the question, if Rptpζ would also act as a tumor suppressor in human OS we performed datasets analyses to identify copy number variations or mutations in the PTPRZ1 gene, yet we did not detect any specific chromosomal or mutational changes. Although the data analysis of 17 human OS samples revealed one heterozygous germline mutation in the PTPRZ1 gene, subsequent in vitro studies showed that it did not interfere with the anti-proliferative activity of the Rptpζ protein. However, Rptpζ is a transmembrane protein with restricted expression pattern. Since it is principally targetable for treatment, it may be important for OS therapy, for example by antagonizing its interaction with Mdk.

The role of Rsk2 in OS pathogenesis was studied in the c-fos transgenic mouse model. Mice over-expressing the transcription factor c-Fos develop osteosarcomas. However, it was recently shown that c-Fos-induced OS development is impaired in mice additionally lacking Rsk2, a kinase modulating c-Fos stability in vitro. This suggested a protective role of Rsk2 inactivation against c-Fos-induced osteosarcoma. Based on the results “mitotic catastrophe” was proposed to be the underlying molecular mechanism was. First indications were obtained by gene expression analyses showing an up-regulation of mitotic genes in c-fos-transgenic tumors lacking Rsk2. Proliferation, immunofluorescence and cell cycle analyses of cell lines established from tumors of c-fos -transgenic mice with or without Rsk2-deficiency, revealed an dramatic growth defect and an increased frequency of multinuclear polyploid cells in the absence of Rsk2. In addition, disorganized multipolar mitotic figures were observed in Rsk2-deficient cells. An important aspect of this project was to analyze whether the genetic inactivation of Rsk2 can be phenocopied by pharmacological inhibition. In fact, respective in vitro experiments performed with c-fos transgenic cells in the presence of the Rsk inhibitor BI-D1870 proved the occurrence of the described phenotype. The growth inhibiting effect of BI-D1870 was also observed in the human OS cell line U2OS as well as in the above-mentioned Trp53-heterozygous cell lines. In summary, these data implied that transformed OS cells undergo incomplete mitosis in the absence of Rsk2, leading to the formation of polynuclear cells with deviant DNA contents. Consequently, these defects result in decreased proliferation and apoptotic cell death. The induction of the so called "mitotic catastrophe" as an onco-suppressive protection mechanism via targeted inhibition of Rsk2 kinase represents a promising approach for the elimination of OS-tumor cells.