Die Kathepsine F und W sind die beiden Vertreter einer erst vor etwa 10 Jahren entdeckten Unterfamilie der schon lange bekannten und gut untersuchten Familie der Papain-ähnlichen Cysteinproteasen des Menschen. In der Arbeitsgruppe gab es Erfahrungen bei der Herstellung und Charakterisierung solcher lysosomaler Proteasen, so dass die Einbeziehung der neuen Unterfamilie naheliegend war. Das Kathepsin-W-Propeptid war bereits erfolgreich exprimiert und charakterisiert worden; ich sollte Ähnliches beim Kathepsin F versuchen. Diese Cysteinprotease erschien auch deshalb interessant, weil es im Vergleich zu allen übrigen Familienmitgliedern eine außergewöhnlich lange Proregion aufweist, die mit 251 mehr als die doppelte Anzahl der sonst in der Proregion vorhandenen Aminosäuren besitzt. Sequenzvergleiche zeigten, dass die N-terminale Verlängerung zu 27 % homolog zum Hühnerei-Cystatin ist, einem seit langem bekannten hochaffinen Inhibitor von Cysteinproteasen, der auch aktives Kathepsin F hemmt. Die Funktion dieser so genannten Cystatin- ähnlichen Domäne ist völlig unklar, denn Prokathepsin F besitzt auch noch die für die Papainfamilie typische „klassische Proregion“, die im Durchschnitt 100 Aminosäuren lang ist und auf Grund ihrer Primärstruktur und der unmittelbaren kovalenten Verknüpfung mit dem N-Terminus der Enzymdomäne sehr wahrscheinlich auch beim Kathepsin F die Substratbindungsstelle abschirmt. Warum hat sich in der Evolution ein Enzym mit zwei potentiellen Inhibitoren entwickeln können? Um Antwort auf diese Frage zu bekommen, war geplant, die Proregion mit und ohne die Cystatin-ähnliche Domäne gentechnisch herzustellen und ihre Wechselwirkung mit vollständigem bzw. um die Cystatin-ähnliche Domäne verkürzten Prokathepsin F und mit dem reifen Enzym zu untersuchen. Das reife Enzym sollte nicht als solches exprimiert werden, denn zur Ausbildung der nativen Konformation ist die Anwesenheit der Proregion erforderlich (so genannte intramolekulare Chaperonfunktion), sondern durch auto- oder heterokatalytische Prozessierung aus einer der beiden Proformen hergestellt werden. Die heterologe Expression all dieser Proteine und Peptide wurde in E. coli durchgeführt; dazu und zur anschließenden Renaturierung der Expressionsprodukte gab es Erfahrungen in der Arbeitsgruppe. Auch zur Reinigung, Identifikation und Charakterisierung von Polypeptiden und zur Aktivitätsmessung von Proteasen waren die apparative Ausrüstung und das Know-how vorhanden, beispielsweise eine FPLC-Anlage mit verschiedenen Säulen, MALDI-ToF, Elektrophoreseapparaturen, fluorogene Substrate und Fluoreszenzreader.