A study on the antagonistic targeting of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) as a potential therapeutic strategy for Asthma bronchiale

In recent years, Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) has emerged as a master switch for actuating cellular inflammation and local remodeling in asthmatic airways. Originally discovered as a growth and proliferation factor of the B cells, thymic stromal lymphopoietin (TSLP) is now implicated in immune system related effects on several cells including B cells, basophils, CD4+, CD8+ and natural killer T cells, dendritic cells, eosinophils, epithelial cells and mast cells. The structural and immune cells express TSLP at the site of allergen entry in the airways. TSLP regulates the T helper 2 (Th2) cells humoral immunity by upregulation of a ligand, OX40L, on the surface of the dendritic cells (DCs), which activates the naive Th0 cells to active Th2 lymphocytes. The role of TSLP in the promotion of Th2 responses has been panoptically studied in the context of several allergic disorders. The experimental work in this thesis is focused on the creation of tools to study/manipulate the signaling of murine TSLP/TSLPR system and thus help us in a better understanding of targeting the TSLP induced signal transduction during allergic inflammation. The studies involved development of a TSLPR expressing luciferase gene based murine cellular model, as well as an inducible TSLP secreting epithelial-dendritic cell based model as readouts. The process involved production, purification and characterization of murine TSLP (mTSLP) as a fusion protein with maltose binding protein (MBP) i.e. mTSLP-MBP and mutant I37E mTSLP-MBP. Exo-mTSLPR domain soluble protein was also produced as a competitive inhibitor and it was then used to generate an anti murine TSLPR antibody for the detection of mTSLPR receptors on the cells. These tools have been successfully tested on the readout systems as mentioned above. The I37E mTSLP-MBP mutant showed partially competitive effects in the cellular readouts. The mTSLPR showed an effective blocking of mTSLP induced signaling. The anti mouse TSLPR antibody could bind to the TSLPR receptors on the cells but it was found to be non inhibitory in nature. By generating the above mentioned inhibitory proteins, novel strategies have been developed to analyze and specifically inhibit TSLP induced immunological activation. The results from these cellular model based studies are in agreement with those obtained from studies involving similar molecules designed for studying human TSLP-TSLPR system in our group in the past. These results cumulatively prove that a successful blockade of the human/murine TSLP-TSLPR system is possible. These results offer an insight into multifaceted roles of TSLP and could potentially pave the way for therapeutic manipulations of allergic disorders.

In den letzten Jahren trat TSLP (Thymic Stromal Lymphopoietin) als ein Hauptakteur in der Auslösung von zellulären Entzündungsreaktionen sowie in asthmatisch bedingten Umbauprozessen in den Atemwegen hervor. TSLP wurde ursprünglich als Wachstums- und Proliferationsfaktor von B-Zellen identifiziert. Heute weiß man, dass TSLP in Effekte des Immunsystems auf verschiedene Zellen wie B-Zellen, Basophile, CD4+-, CD8+- und Natürliche Killer-T-Zellen, Dendritische Zellen, Eosinophile, Epithelzellen sowie Mastzellen involviert ist. In den Atemwegen wird TSLP in Struktur- und Immunzellen am Ort des Allergeneintritts exprimiert. Dabei reguliert TSLP die humorale Immunantwort von Typ2-Helfer-Zellen (Th2-Zellen) über die Aktivierung des OX40-Liganden auf der Oberfläche von Dendritischen Zellen, wodurch wiederum naive T-Helferzellen zu aktiven Th2-Lymphozyten aktiviert werden. Im Kontext verschiedener allergischer Erkrankungen wurde die Rolle von TSLP in der Promotion der Th2-Antwort umfassend studiert. Der experimentelle Teil der vorliegenden Arbeit war fokussiert auf die Entwicklung von Werkzeugen, um die Signalprozesse des murinen TSLP/TSLP-Rezeptor-Systems zu studieren bzw. manipulieren, mit dem Ziel, die TSLP-induzierten Signal-Transduktionsprozesse während der allergischen Reaktion besser zu verstehen und zu beeinflussen. Die Studien beinhalteten die Entwicklung von „Readout“-Systemen, einerseits eines Luziferase-Reportergen-Assays gekoppelt an die TSLPR-Expression in einem murinen Zellmodell sowie andererseits ein induzierbares dendritisches Epithelzellmodellsystem zur Sekretion von TSLP. Die Arbeit beinhaltete die Produktion, Aufreinigung und Charakterisierung von murinem TSLP als Fusionsprotein mit Maltose-bindendem Protein (MBP), dem mTSLP-MBP und der Mutante I37E mTSLP-MBP. Die Extrazelluläre Domäne des TSLP-Rezeptors (exo-mTSLPR-Domäne) wurde zudem als kompetitiver Inhibitor produziert und zur Generierung von monoklonalen anti-murin-TSLPR-Antikörpern zur Detektion des zellulären TSLPRs genutzt. Diese Werkzeuge wurden erfolgreich mit den vorgenannten „Readout“-Systemen getestet. Der mTSLPR zeigte eine effiziente Blockierung der durch mTSLP induzierten Signalübertragung. Der generierte monoklonale Maus-mTSLPR-Antikörper wies eine positive Bindung an den zellulären TSLPR auf und zeigte keine inhibitorischen Effekte auf die Signalübertragung.Mit der Generierung der inhibitorisch wirksamen TSLP-Proteine konnten neue Strategien zur Analyse sowie spezifischen Inhibierung der TSLP-induzierten Immunreaktion entwickelt werden. Die Ergebnisse aus den Zellmodell-basierenden Studien der vorliegenden Arbeit stimmen mit vergangenen Studien der Arbeitsgruppe überein, in welchen ähnliche Moleküle konstruiert wurden, um das humane TSLP/TSLPR-System zu untersuchen. Insgesamt beweisen diese Ergebnisse, dass eine erfolgreiche Blockade des humanen/murinen TSLP/TSLPR-Systems möglich ist. Zudem gibt die vorliegende Arbeit einen Einblick in die vielseitige Rolle von TSLP und könnte möglicherweise den Weg in die therapeutische Manipulierung im Rahmen von allergischen Erkrankungen ebnen.  

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