In this thesis a promising new superresolution technique called Optical Photon Reassignment (OPRA) microscopy is introduced and applied to the field of fluorescence microscopy. The method is a optical realization of the computer-based reassignment principle in confocal microscopy introduced by Sheppard in 1988 [17]. There, the spatial information in the pinhole plane is used to increase the resolution. In the year 2010 this method received a lot attention as Müller and Enderlein published the same principle including experimental data from fluorescent samples [23]. As in OPRA the computational reassignment process is done optically, any necessary processing is avoided and only one camera readout is required. The microscopy concept, together with proof-of-principle experiments and a mathematical framework, was published and patented in 2013 [24, SR1]. The method combines several important properties of fluorescent imaging towards non invasive live-cell imaging in a unique way. OPRA achieves two-fold resolution enhancement in the focal plane if compared with the cut-off frequency of standard widefield microscopy. As OPRA does not require any processing, it is suitable for extremely fast imaging, especially if the method is parallelized. The imaging speed of the method is mostly limited by the scan speed. This is a system inherent advantage to other superresolution techniques as SIM or the pointillistic methods as PALM and dSTORM where several camera readouts are necessary. In [SR2] the special property of OPRA named "superconcentration" is introduced and discussed. This property describes, that the peak-intensity, compared to widefield microscopy, is increased and therefore the light is better concentrated than classical limits predicts. The theoretical background of this measurement concept was used for a general comparison of the microscopes OTF [SR4]. As the reassignment of the photons occurs in the pinhole plane, it is in general a two dimensional process. However, there is an effect along the optical axis as well. In [SR3] it could be shown, that it is possible to improve the axial resolution by more than 10% over the resolution of a confocal microscope for reasonable big pinholes if OPRA is combined with structured illumination. This combination has the advantage, that the relatively large pinhole maintains the high signal level of OPRA. In figure 2.2 the interaction of several important properties in modern superresolving fluorescent microscopy are illustrated in a simplified scheme. OPRA is able to link several characteristics in a new, unrivalled way. The described properties of OPRA have the potential to replace the confocal microscope as standard technique for biomedical imaging. OPRA in the parallelized realization is suitable for imaging of fast processes in living cells and is therefore a promising method to help answering important biomedical questions in the coming years of research. These properties of the optical reassignment methods lead to the development of several commercial products as the Re-Scan Confocal [25, 26], the spinning-disk variant (SD-OPR) by Yokogawa Electric Corporation [27, 28] or the multi-beam realisation called Vt-SIM by Visitech Int. [29].
Die hier vorgelegte Arbeit beschäftigt sich mit einem neu entwickelten superauflösenden Verfahren der Fluoreszenz-Mikroskopie. Das Prinzip der optischen Photonen-Zuweisung (Optical Photon Reassignment, OPRA) macht es möglich auf der Basis von Laser-Scanning-Mikroskopen (LSM) in Kombination mit einem ortsaufgelösten Detektor superauflösende Bilder zu erhalten [SR1]. Die OPRA Methode basiert auf dem Prinzip der computergestützten Pixelzuweisung, welches erstmals 1988 von C. Sheppard beschrieben wurde [17]. Viel Aufmerksamkeit erlangte dieses Mikroskopie-Konzept 2010 unter dem Namen “Image Scanning Microscopy (ISM)“, als mit Hilfe moderner Kameras hoch auflösende Bilder fluoreszierender Polymerkugeln aufgenommen wurden. In OPRA wird dieses computerbasierte Reassignment-Verfahren optisch realisiert, so dass es möglich ist, vollständig auf die Verwendung aufwendiger Rechenverfahren zu verzichten. Anhand der Messung von fluoreszenten Proben konnte gezeigt werden, dass es mit diesem neu entwickelten Konzept möglich ist, in nur einer einzigen Kamerabelichtung Bilder mit einer, im Vergleich zum Abbe-Limit, deutlich verbesserten Auflösung aufzunehmen. Zudem konnte gezeigt werden, dass dabei kein Fluoreszenzsignal verloren geht und somit das Licht besser auf der Kamera konzentriert wird, als es das Gesetz der Étendue-Erhaltung vorherzusagen scheint. Diese Eigenschaft wurde in Anlehnung an der etablierten Begriff der “Superauflösung“ als “Superkonzentration“ bezeichnet [SR2]. In [SR3] wurde das Verfahren auf die dritte Dimension erweitert. Dabei wurden verschiedene Ansätze zur Verbesserung der axialen Auflösung mit Hilfe einer Detektionsapertur und strukturierter Beleuchtung unter Berücksichtigung der “Superkonzentration“ diskutiert und experimentell evaluiert. Zudem konnte dieses Konzept in [SR4] verwendet werden um ein allgemeines Konzept zur Beurteilung von Mikroskopietechniken zu entwickeln. Dieses Konzept der normierten optischen Transferfunktionen (OTF) wurde am Beispiel der rechnergestützten Pixelzuweisung eingeführt. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial der Methode für die biomedizinische Bildgebung, da sie in vorher nicht bekannter Weise wichtige Eigenschaften hochauflösender Mikroskopie wie Sensitivität (was zu einer Verringerung der erforderlichen Beleuchtungsintensität führt) und Auflösung miteinander verbindet. Dabei schaffen es die Methoden, welche auf dem Prinzip der optischen Photonen-Zuweisung beruhen, zweifache laterale Auflösungserhöhung (in Bezug auf die Grenzfrequenz der Weitfeld-Mikroskopie) mit erhöhter Sensitivität bei nur einer benötigten Kamerabelichtung zu verbinden ohne dabei spezielle Anforderungen an die Probenpräparation zu stellen. Aufgrund der, im Vergleich zu herkömmlichen Laser-Scanning-Verfahren, erhöhten Sensitivität ist es möglich, die Beleuchtungsintensitäten zu verringern. Damit eignen sich die Konzepte, welche auf der optischen Photonen-Zuweisung beruhen, besonders für die Untersuchung biologischer Prozesse in lebenden Zellen. Der Zusammenhang zwischen wichtigen Eigenschaften optischer Mikroskopiemethoden ist in Abbildung (1.1) dargestellt. Es ist leicht verständlich, dass erhöhte (zeitliche und räumliche) Auflösung immer mit erhöhter Beleuchtungsdichte einhergeht, weshalb dieEigenschaft der “Superkonzentration“ ein entscheidender Parameter in der praktischen Anwendung von OPRA ist. Der Probenpräparation kommt aufgrund der Vielfalt an Markierungstechniken und entsprechenden Fluorophoren eine besondere Bedeutung zu. Gerade die pointillistischen Methoden und STED stellen an die verwendeten Fluorophore hohe spezifische Anforderungen [18, 19]. Hier besitzt OPRA als generelles Konzept eine deutlich vergrößerte Vielseitigkeit. Zudem ist das Prinzip der Pixelzuweisung nicht auf den Prozess der Fluoreszenz beschränkt und lässt sich auch auf andere Scanning-Verfahren, wie z.B. konfokale Raman-Mikroskopie, erweitern [20].
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