Untersuchungen zur Konformation und proteolytischen Stabilität von thioxylierten Oligopeptiden

Abstract

Thioxylierungen sind Peptidrückgrat-Modifikationen in Form eines Sauerstoff - Schwefel Austausches in der Peptidbindung. Derartige Thioxopeptide zeigen einige spezifische Eigenschaften. In spektroskopischen Untersuchungen sind die pi-pi* Übergänge des Thioxopeptid-Chromophors bathochrom in den Bereich um 270 nm verschoben. Sie zeigen Extinktionskoeffizienten größer 10 000, sowohl in den UV/VIS- als auch CD-Spektren. Das CD-Signal gibt die Chiralität in der Umgebung thioxylierter Peptidyl-Prolyl-Peptidbindungen wieder und erlaubt die Messung der cis/trans Isomerisierung. Weiterhin ist es möglich, das cis/trans Gleichgewicht durch Anregung der Thioxopeptidbindung mit UV-Licht zu höheren cis-Gehalten hin zu verschieben. Veränderungen der Eigenschaften von Thioxopeptidbindungen widerspiegeln sich auch in deren chemischen Reaktionen. Derivate, deren erste (N-terminale) Aminosäure thioxyliert ist, reagieren mit stöchiometrischen Mengen von in wäßrigen Puffern (pH 8) gelöstem Formaldehyd zu den entsprechenden Azomethinen. Die Thioxylierung der zweiten Aminosäure erleichtert einen nucleophilen Angriff durch die terminale Aminogruppe auf den Thioxocarbonyl-Kohlenstoff, der zu einer Umwandlung in zyklische 2-Keto-5amino-4,5-dehydro-piperazin Derivate führt. Thioxopeptidbindungen sind wegen der höheren Acidität der Amidgruppe bessere Donoren für Wasserstoffbrückenbindungen, hingegen ist die reduzierte Basizität des Schwefels für verminderte Akzeptoreigenschaften verantwortlich. Die Serinproteasen alpha-Chymotrypsin, Subtilisin Carlsberg und Prolyloligopeptidase sind in der Lage, Thioxopeptidbindungen, die den aktivierten 4-Nitroanilidrest als Abgangsgruppe tragen, zu proteolysieren, jedoch mit um 3 Größenordnungen reduzierten kcat und kcat/Km-Werten. Die Cysteinprotease Papain proteolysiert die gleiche Gruppe von Derivaten sogar besser als die entsprechenden Oxo-Verbindungen, vorwiegend wegen der niedrigeren Km-Werte. Keine der Proteasen ist in der Lage, die nichtaktivierte, zwei proteinogene Aminosäuren verbindende, Thioxopeptidbindung zu proteolysieren. Jedoch können sie im Zuge der Proteolyse der aktivierten Thioxopeptide ein Thioxoacylenzym bilden. Dessen Übertragung auf ein geeignetes Amin-Nucleophil (Aminosäureamid, Peptid) im Deacylierungsschritt resultiert in einer kinetisch kontrollierten Thioxopeptidsynthese. Ein blockierter Protonentransfer vom protonierten Histidin-Rest auf die austretende Amidgruppe wird als Ursache für die Proteolyse-Resistenz der nichtaktivierten Thioxopeptide postuliert. Die Proteolyse findet jedoch statt, wenn der Protonentransferschritt nicht essentiell ist (wie bei den aktivierten Thioxopeptidbindungen) oder wenn eine alternativer Protonentransfer-Mechanismus wirkt, wie für die Dipeptidylpeptidase IV postuliert. Diese war als einzige der untersuchten Proteasen in der Lage, auch nichtaktivierte Thioxopeptidbindungen zu proteolysieren.

Thioxylations are peptide backbone modifications in terms of an oxygen to sulphur substitution in the peptide bond. Such thioxo peptides show some specific properties. In spectroscopic investigations the pi-pi* transitions of the thioxo peptide chromophore are shifted bathochrome to about 270 nm, showing absorption coefficients higher than 10 000, both in the UV/VIS- and CD-spectra. The CD-signal is sensitive to the chirality in the environment of thioxylated peptidyl prolyl peptide bonds, allowing to measure the cis/trans isomerisation. Furthermore it is possible to shift the cis/trans equilibrium in favour to cis by excitation of the thioxo peptide bond using UV-light. Changes in the thioxo peptide bond properties are reflected in chemical reactions too. Derivatives containing a thioxylated first (N-terminal) amino acid react with stoichiometric amounts of formaldehyde dissolved in hydrogenous buffers (pH 8) forming the corresponding azomethins. The thioxylation of the second amino acid facilitates a nucleophilic attack by the terminal amino group to the thioxo carbonyl carbon resulting in a transformation to cyclic 2-Keto-5-amino-4,5-dehydro-piperazine derivatives. Thioxo peptide bonds are better hydrogen bond donors because of the higher acidity of the amide moiety, however the reduced basicity of the sulphur causes weaker hydrogen bond acceptor properties. Serine proteases alpha-chymotrypsin, subtilisin Carlsberg and prolyl oligopeptidase were able to proteolyse thioxo peptide bonds containing the activated 4-nitroanilide residue as leaving group, however with three orders of magnitude reduced kcat and kcat/Km values. Cysteine protease papain cleaves the same group of derivatives even better than the corresponding oxo-compounds, mainly due to a lower Km-value. All proteases fail to cleave non-activated thioxo peptide bonds connecting proteinogenic amino acid residues. However they are able to form a thioxo acyl enzyme in the course of proteolysis of activated thioxo peptide bonds. Transfer of the thioxo acyl moiety to an appropriate amine nucleophile (amino acid amide, peptide) in the deacylation step results in kinetically controlled thioxo peptide synthesis. A blocked proton transfer from the protonated active site histidine residue to the leaving amide moiety is postulated as a reason for the proteolytic stability of non-activated thioxo peptide bonds. However proteolysis occurred, if the proton transfer step is not essential (like in the activated thioxo peptide bonds) or if an alternative proton transfer mechanism is working, as postulated for dipeptidyl peptidase IV, the only enzyme under investigation, that is able to cleave non-activated thioxo peptide bonds too.