Cloning, molecular biological and physical characterization of two isoforms of tobacco protoporphyrinogen IX oxidase

Abstract

Protoporphyrinogen IX-Oxidase (PPOX) ist das letzte gemeinsame Enzym in der Biosynthese von Häm und Chlorophyll. Zwei unterschiedliche und vollständige cDNA-Sequenzen, welche die plastidäre bzw. die mitochondriale Isoform der PPOX kodieren, konnten mittels eines Komplementationsansatzes kloniert werden. Durch die Expression der pflanzlichen cDNAs in der Protoporphyrinogen IX-akkumulierenden hemG-Mutante von Escherichia coli wurde die Häm-Auxotrophie aufgehoben. Sowohl das plastidäre (PPOX I) als auch das mitochondriale Isoenzym (PPOX II) wurde in E. coli überexprimiert, wobei sich nur jene Stämme, in denen das mitochondriale rekombinante Enzym produziert wurde, durch eine erhöhte PPOX-Aktivität auszeichneten. Das plastidäre Enzym hingegen konnte nur in einer inaktiven Form gewonnen werden. PPOX ist das molekulare Ziel von Herbiziden des Diphenylether (DPE)-Typs. Deren inhibitorische Wirkung wird mit der raschen Oxidation von akkumulierendem Protoporphyrinogen IX begründet, was zur Bildung von photosensibilisierendem Protoporphyrin IX und der nachfolgenden Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies führt. Mehrere Strategien wurden zur Erzeugung von Pflanzen entwickelt, die gegenüber diesen Herbiziden resistent sind. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei dieser Ansätze verfolgt. Der erste Ansatz sah vor, transgene Tabakpflanzen zu generieren, die entweder PPOX I oder PPOX II überexprimieren. Tabakpflanzen, die PPOX I aus Arabidopsis thaliana exprimieren, zeigten in der Tat eine deutlich erhöhte Resistenz gegenüber dem DPE-Typ Herbizid Acifluorfen, wohingegen Pflanzen, die PPOX II aus der gleichen Quelle produzierten, nur geringfügig resistenter gegenüber dem Hemmstoff waren. Verschiedene Experimente wurden durchgeführt, um den Mechanismus der Resistenz aufzuklären. Im zweiten Ansatz wurde die PPOX I-cDNA-Sequenz aus Tabak im E. coli Mutator-Stamm XL-Red mutagenisiert. Die mutierten Plasmide wurden in den Häm-defizienten E. coli Stamm hemG re-transformiert, und anschließend wurde auf Medium mit ansteigender Acifluorfen-Konzentration nach resistenten Bakterienkolonien gesucht. Drei cDNAs aus resistenten Bakterienklonen wiesen unabhängige Punktmutationen im kodierenden Bereich der PPOX I-cDNA auf, welche zum Austausch von Aminosäuren führen. Alle drei Mutationen sind in einem Abschnitt lokalisiert, der stark konservierte Aminosäurereste enthält. Um die Auswirkungen von PPOX-Defizienz zu untersuchen, wurden transgene Tabakpflanzen konstruiert, die das PPOX I-kodierende Gen in umgekehrter (Antisense) Orientierung enthalten. Diese Pflanzen weisen erniedrigte Gehalte von PPOX I auf, sind stark geschädigt und zeichnen sich durch ihr reduziertes Wachstum aus. Die Ausbildung von Blattnekrosen hängt dabei umgekehrt proportional von der Lichtintensität ab. Die Gehalte an Antioxidantien in den transgenen und Kontrollpflanzen unter den unterschiedlichen Lichtintensitäten wurden bestimmt und der daraus abgeleitete Einfluß auf den Grad der Photosensibilisierung der Pflanzen wird diskutiert.

Protoporphyrinogen IX oxidase (PPOX) is the last enzyme in the common pathway of heme and chlorophyll biosynthesis. Two different full length tobacco cDNA sequences encoding plastidal and mitochondrial PPOX were cloned by complementation of the protoporpyhrin IX (Proto IX) accumulating E. coli hemG mutant rescuing it from heme auxotrophy. The mature plastidal and the mitochondrial isoenzyme were overexpressed in E. coli. Bacterial extracts containing the recombinant mitochondrial enzyme exhibit high PPOX activity relative to control strains, while the plastidal enzyme could only be expressed as an inactive peptide. PPOX is the molecular target of diphenyl ether type (DPEs) herbicides. Their inhibitory mode of action is explained by rapid oxidation of accumulating protoporphyrinogen IX (Protogen IX) to the photosensitizing Proto IX, which subsequently generates reactive oxygen species (ROS) during oxidative breakdown. Several strategies have been developed to obtain plants resistant toward such peroxidizing herbicides. In presented work two different approaches were used to obtain herbicide resistance. In the first approach, transgenic tobacco plants overexpressing either plastidal or mitochondrial isoform of PPOX were generated. Plants with overexpressed Arabidopsis PPOX I showed resistance against acifluorfen, while plants overexpressing PPOX II were only slightly resistant against the PPOX inhibitor. Various experiments were performed to elucidate the resistance mechanism. In the second approach, the tobacco PPOX I cDNA sequence was randomly mutagenised in the E. coli XL-Red mutator strain. The mutated plasmids were retransformed into E. coli hemG mutant and resistant bacterial colonies were selected on increasing concentrations of the PPOX inhibitor acifluorfen. Three PPOX I cDNAs selected from resistant bacterial clones showed point mutations in the PPOX I coding region leading to the substitution of a different amino acid. All three mutations are located in the cDNA sequence for highly conserved amino acid residues. To study the effect of PPOX I deficiency, transgenic plants carrying a gene for PPOX I in antisense orientation were generated. Transgenic plants with PPOX I antisense genes showed a reduced levels of PPOX I leading to extremely damaged plants with dwarf-phenotype. The formation of necrotic leaf lesions inversely depends on the light intensities. The levels of antioxidants of transgenic and control plants grown under low and high light conditions were investigated and the mechanism of photosensitization is discussed.