Biotechnologische Anwendungen polyionischer Fusionspeptide

Abstract

In der vorliegenden Dissertation wird die Multifunktionalität polyionischer Fusionspeptide für die Reinigung, Renaturierung und gerichtete Assoziation rekombinanter Proteine dargestellt. Mittels gentechnischer Methoden wurden ein Fab-Fragment und ein Enzym (α-Glucosidase aus Saccharomyces cerevisiae) mit einem polyionischen Fusionspeptid versehen. Dieses besteht aus einer Abfolge von 10 entweder positiv oder negativ geladenen Aminosäuren und einem zusätzlichen Cystein-Rest. Es wird gezeigt, daß die modifizierten Proteine in rekombinanten Escherichia coli exprimiert und mit Hilfe der geladenen Fusionspeptide an den komplementär geladenen Ionenaustauschern gereinigt werden können. Zusätzlich wurde das polyanionische Fusionspeptid für eine matrix-unterstützte Reaktivierung der α-Glucosidase verwendet. Die Entwicklung einer neuartigen kovalenten Affinitäts-chromatographie ermöglicht den Nachweis der C-terminalen polyanionischen Fusionspeptide. Desweiteren wurden die komplementär geladenen Fusiosnpeptide als Dimerisierungsmodul verwendet. Durch die gerichtete Assoziation über die komplementär geladenen Fusionspeptide und nachfolgende kovalente Verknüpfung über die zusätzlichen Cystein-Reste konnte ein Fab-Fragment-Enzym-Konjugat gebildet werden. Dabei werden die Antigenbindungseigenschaften und die enzymatische Aktivität der Assoziationspartner verglichen mit dem isolierten Zustand nicht beeinträchtigt.

This thesis demonstrates, that polyionic fusion peptides own multiple functions in protein purification, renaturation and directed association. A Fab-fragment and an enzyme (α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae) were genetically modified by appending a polyionic fusion peptide. The fusion peptides consist of ten either positively or negatively charged aminoacids and an addional cysteine residue. It is demonstrated, that the modified proteins can be produced in recombinant Escherichia coli and purified on complementarily charged ion exchange materials. Further, the polyanionic fusion peptide is used for matrix-assisted refolding of α-glucosidase. A special kind of a covalent affinity chromatography was developed in order to characterize proteins possessing C-terminal polyanionic fusion peptides. Further, complementarily charged polyionic fusion peptides function as dimerization motif. Using complementarily charged polyionic fusion peptides for directed association and covalent linkage by the engineered cysteine-residues, a Fab-Fragment-enzyme-conjugate was formed. Antigen binding activity and enzymatic activity were not impaired compared to the isolated state.