Development and evaluation of monolithic columns for protein analysis - [kumulative Dissertation]

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden monolithische stationäre Phasen entwickelt und bewertet mit dem Ziel Proteinanalysen durch die Verwendung von multidimensionaler Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC/MS/MS) zu verbessern. Ein monolithischer Trypsinreaktor und eine monolithische Affinitätssäule mit monomeren Avidin wurden hergestellt und die Anwendungsparameter optimiert. Der Einbau des monolithischen Trypsinreaktors in ein online 2D nano-HPLC/nano-ESI-LTQ-Orbitrap-MS/MS System ermöglichte die automatisierte Spaltung, Trennung und Analyse von Proteinen innerhalb von 90 Minuten. Schließlich wurden beide monolithischen Säulen erfolgreich in ein online 3D nano-HPLC/nano-ESI-Q-TOF-MS/MS System integriert. Dadurch wurde die automatisierte Spaltung biotinylierter Proteine, die Anreicherung der biotinylierten Peptide, die anschließende Trennung der biotinylierten Peptide mittels Umkehrphasenchromatographie und deren massenspektrometrische Analyse erreicht.

In the course of this work, monolithic stationary phases were developed and validated for improving protein analysis using multi-dimensional liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC/MS/MS). A monolithic trypsin reactor and a monolithic affinity column with monomeric avidin were prepared and the operation parameters were optimized. Integration of the trypsin reactor into an online 2D nano-HPLC/nano-ESI-LTQ-Orbitrap-MS/MS system enabled an automated digestion, separation, and analysis of proteins within 90 minutes. Finally, both monolithic columns were successfully integrated into an online 3D nano-HPLC/nano-ESI-Q-TOF-MS/MS system for the automated digestion of biotinylated protein, the enrichment of biotinylated peptides, and the subsequent separation by reversed phase chromatography and analysis using mass spectrometry.