Chemochips - Development and Application of Analytical Micro Spot Arrays

Die im Vergleich zu DNA-Chips weniger entwickelte Proteinchiptechnologie zeigt das Problem einer nicht vorhandenen universellen Erkennungsfunktion oder Strategie für universell einsetzbare Chips für die Vielzahl von Proteinproben. Der Grund dafür ist die chemische Komplexität, die Proteine als Translationsprodukt eines Basisgens (DNA) tragen. Es existiert hierbei der grundsätzliche Widerspruch zwischen einer „chemischen Spezifität der Erkennung“ und einer „universellen Einsatzmöglichkeit“ solch einer Mikroarray-basierten Erkennung, die mit der höheren chemischen Komplexität umgehen muß. Die Kernfrage ist dabei, können unterschiedliche Analyse- und Auslesemethoden in einer Plattform kombiniert werden, indem eine Integration spezifischer und weniger spezifischer analytischer Erkennungsmethoden erfolgt. Die Adressierung des Problems zur universellen Anwendung von Chips für die spezifische Analyterkennung erfolgte bei dieser Integration. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Integration verschiedenster Charakterisierungs- und Auslesemethoden zu einer Chiptechnologie für die chemische Erkennung von Flüssigkeiten.Um multifunktionale Chemochips zu entwickeln, wurden moderne Analysen- und Auslesetechniken wie berührungsfreies Mikrospotting, digitale Fluoreszenzaufnahmen und AFM-Techniken verwendet. Die Mikrospot-Technik wurde zur Erzeugung vom Mikroarrays, die reine Indikatoren und Indikatormischungen als Funktionselement enthielten, sowie zur örtlich begrenzten chemischen Matrixmodifikation genutzt. Ein Fluoreszenz-Imagingverfahren mittels schneller CCD-Kamera ermöglichte die Echtzeitaufnahme einer Bildserie der Analyt-Indikator-Wechselwirkung bei mehreren Anregungs- und Emissionswellenlängen. Für eine bessere Analytklassifikation wurde eine multivariate Datenanalyse auf den erhaltenen Datenpool, der sich aus Fluoreszenzintensitätsänderungen der Spots mittels Bildanalyse ergab, angewandt. Neben diesen etablierten Auswertemethoden kam eine speziell entwickelte hochauflösende Nanopositionier- und Nanomeßmaschine mit eingebautem AFM-Modus (SPM-NPMM) zum Einsatz, um die Mikrospotarrays auf einer Strecke von einigen Millimetern mit der Auflösung und der Präzision eines AFMs zu untersuchen. Die SPM-NPMM besitzt einen großen dynamischen Meßbereich von 25 × 25 × 5 mm3 mit einer lateralen Auflösung von 0.1 nm. Messungen mit der SPM-NPMM zeigten, daß die Verdampfung des Lösemittels nach dem Spotting zu der Ausbildung eines konzentrischen Doppelkranzes innerhalb der Mikrospots führt. Dieses charakteristische Doppelkranz-Merkmal der Mikrospots konnte nur bei Verwendung binärer Lösemittelmischungen mit unterschiedlichen Polaritäten der Komponenten, wie bei Wasser und DMF, gefunden werden. Die Ursache dafür ist der unterschiedliche Transport des gelösten Materials in zwei verschiedenen Lösemitteln während der Ausbildung der Spots. Hochaufgelöste SPM-NPMM-Messungen zeigten, daß die inhomogene Verteilung von Farbstoff-Nanokristallen, deren Höhe 2 – 5 nm betrug, auf den inneren Kranz eines Doppelkranz-Spots begrenzt war. Ursächlich ist die verminderte Löslichkeit des Farbstoffes in DMF.Die qualitative und quantitative Differenzierung von binären Lösemittelmischungen wurde durch die Verwendungen eines einlagigen Chemochips mit pH- und polaritätsempfindlichen Farbstoffen möglich. Mittels Mikroarray-Muster konnten die Analyten mit einem vergleichbaren Alkoholgehalt von 5 Vol.-%, wie in einer Wasser-Ethanol-Mischung, verschiedenen Bieren oder anderen alkoholischen Getränken, qualitativ von einander unterschieden werden. Die Variation im Muster der Fluoreszenzspots agierte als Fingerprint komplex zusammengesetzter Flüssigkeiten wie Mischungen und Getränke. Die multivariate Datenanalyse des erhaltenen Datenpools aus den Chemochip-Experimenten ermöglichte die Unterscheidung bestimmter Klassen binärer Gemische. Ebenso lassen sich einige andere Mikroarray-Komponenten, wie Spots binärer Farbstoffgemische, auf ihr Antwortverhalten bezüglich einer Vielzahl von flüssigen Analyten durch Verwendung der PCA-Analyse klassifizieren. Analytische Doppellagen-Chemochips wurden durch die Aufteilung der Funktionen „Differenzierung“ in der oberen Schicht und „Indikation“ in der unteren Schicht desselben Chips hergestellt. Die Realisierung erfolgte durch Stapelung von Hydrogel-Polymerlagen mit Matrixmodifizierern durch Einsatz der Lösemittel-Guß-Methode. Die mobilitätsabhängige Differenzierung der oberen Schicht wurde durch physikalische Umwandlung der Polymermatrix durch quervernetzende Stoffe erreicht. Die Indikatorfunktion der unteren Schicht konnte durch eingelagerte fluoreszierende Farbstoffe realisiert werden. Es war damit möglich, verschiedene Analyten durch die Diffusionszeit während des Durchtritts durch die Differenzierungsschicht mittels Echtzeitaufnahme von Bildserien und deren Auswertung zu unterscheiden. Die Moleküle der Analyten zeigten Variationen in den Übertrittszeiten ihres Transports durch die obere Schicht in Abhängigkeit des Vernetzungsgrades der Polymermatrix. Dieser Transport von Einzel- und Mischungsanalyten durch die Differenzierungsschicht konnte auch detektiert werden, wenn das Fluoreszenzschema der Singlelayer-Chips verwendet wurde. Der Doppellagen-Chemochip zeigte auch das Analyt-Separationssignal für eine Mischung zweier verschiedener Analytmoleküle währender derer Diffusion durch die Differenzierungsschicht. Dieses Verhalten kann den bevorzugten Wechselwirkungen zwischen Analyt und der modifizierten Polymerumgebung als Transportmedium zugeordnet werden.Die offene Problemstellung von „Spezifität gegenüber Universalität“, belegt durch weniger entwickelte Biochips wie den Proteinchips, wurde in der vorgelegten Arbeit durch Verwendung verschiedenen Typen von Chemochips adressiert. Es konnte gezeigt werden, daß mittels Einzel- und Doppellagenchips mit fluoreszierenden Mikroarrays verschiedene bevorzugte und allgemeine Charakterisierungen möglich sind.