Dokument: Analyse des Substratspektrums der ClpCP-Protease aus Corynebacterium glutamicum

Titel:	Analyse des Substratspektrums der ClpCP-Protease aus Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Analysis of the substrate spectrum of the Corynebacterium glutamicum ClpCP-protease
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5652
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070907-094500-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schweitzer, Jens-Eric [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,53 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.09.2007 / geändert 05.09.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:	Corynebacterium glutamicum, Clp, Proteolyse
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der konditionale Abbau von Proteinen durch ATP-abhängige Proteasen ist ein wichtiges regulatorisches Prinzip. Mit ClgR, dem Transkriptionsregulator von Genen, die an der Proteolyse und der DNA-Reparatur beteiligt sind, und GlnK, dem PII-Typ-Regulator der Stickstoffmangel-Antwort, sind bereits zwei Substrate der ClpCP-Protease aus Corynebacterium glutamicum bekannt. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung weiterer Substrate von ClpCP und die Bestimmung von Sequenzmotiven innerhalb dieser Substrate, die für eine Erkennung durch ClpC wichtig sind. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt: 1. Zur Co-Reinigung von Substraten mit inaktiven ClpP-Derivaten, bei denen der katalytisch aktive Serin-Rest durch einen Glycin-Rest ersetzt worden war und die einen C-terminalen StrepTag-II trugen, wurden die beiden so genannten Substratfallenstämme ClpCP1TRAP und ClpCP2TRAP konstruiert. StrepTactin-Affinitätschromatographie von Extrakten dieser Stämme führte zur Co-Reinigung von 61 Proteinen mit ClpP1*-ST bzw. ClpP2*-ST, von denen 14 in mindestens fünf der zehn Reinigungen mit inaktivem ClpP1 und ClpP2 auftraten. Die Proteine konnten in unterschiedliche Funktionsklassen wie Translation, Chaperone, Aminosäuremetabolismus und Energiemetabolismus eingruppiert werden. Eine Co-Reinigung war auch mit ClpP-Derivaten möglich, die den Serin-Glycin-Austausch nicht besaßen, was auf eine Inaktivierung dieser Derivate bereits durch den C-terminalen StrepTag-II hindeutet. 2. Kontrollexperimente unterstützten eine Spezifität der Co-Reinigung dieser Proteine für ClpP1 und ClpP2. Die plasmid-kodierte E1-Untereinheit des a-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes (OdhA) mit C-terminalem StrepTag-II wurde ohne Co-Reinigung weiterer Proteine aus demselben Stammhintergrund isoliert wie ClpP1*-ST oder ClpP2*-ST. Eine Co-Reinigung von Proteinen mit prozessiertem ClpP1, das ein N-terminales StrepTag-II trägt, war ebenfalls nicht möglich. 3. Aus den mit ClpP co-gereinigten Proteinen wurden 10 N-terminale und 10 C-terminale putative ClpC-Erkennungssequenzen abgeleitet. Durch Bestimmung der Halbwertszeit von Fusionsproteinen mit den 10 N-terminalen Sequenzmotiven konnten acht Motive bestimmt werden, die in Anwesenheit von ClpC einen negativen Einfluss auf die Stabilität der Fusionsproteine hatten. Diese Motive könnten also Erkennungssequenzen von ClpC darstellen. Conditional degradation of proteins by ATP-dependent proteases is an important regulatory principle. Analyses on ClgR, the transcriptional regulator of genes involved in proteolysis and DNA repair, and GlnK, a PII-type signal transduction regulatory protein of Nitrogen starvation, revealed that these proteins are substrates of the Corynebacterium glutamicum ClpCP-protease. Aim of this work was to identify further substrates of ClpCP and to determine how ClpC can recognise these substrates. The following results were achieved answering these questions: 1. Strains for the co-purification of substrates with inactive ClpP-derivatives harbouring a mutation of the catalytic active serine to glycine and a C-terminal StrepTag-II were successfully constructed and named ClpCP1TRAP and ClpCP2TRAP. StrepTactin affinity chromatography of extracts of ClpCP1TRAP and ClpCP2TRAP led to the co-purification of 61 proteins, of which 14 occurred at least in five of ten purifications of inactive ClpP1 and ClpP2. These putative substrates could be subdivided into different functional classes like translation, chaperones, amino acid metabolism and energy metabolism. Co-purification was also possible with ClpP derivatives lacking the Ser-Gly mutation suggesting an inactivation of these derivatives by the C-terminal StrepTag-II. 2. Control experiments were made to support the specificity of the co-purification for ClpP1 and ClpP2. Purification of the plasmid encoded E1-subunit of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex (OdhA) with a C-terminal StrepTag-II in the same genetic background as purification of ClpP1*-ST or ClpP2*-ST revealed no co-purification of other proteins. Co-purification of proteins with a processed ClpP1 derivative containing an N-terminal StrepTag-II was not possible, too. 3. Investigation on the termini of the co-purified proteins showed 10 N-terminal and 10 C-terminal putative recognition motives for ClpC. Determination of the half-life of protein fusions with the 10 N-terminal sequence motives showed that eight motives had a negative influence on the stability of the protein fusions. These motives might exhibit ClpC recognition sites.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe
Dokument erstellt am:	05.09.2007
Dateien geändert am:	05.09.2007
Promotionsantrag am:	22.05.2007
Datum der Promotion:	25.06.2007