Dokument: Interaktionen der Protein-O-Mannosyltransferasen aus Candida albicans

Titel:	Interaktionen der Protein-O-Mannosyltransferasen aus Candida albicans
Weiterer Titel:	Interaction of protein-O-mannosyltransferases in Candida albicans
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6778
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080122-094713-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schmidt, Inga [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,26 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.01.2008 / geändert 21.01.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	Pmt Glykosylierung Candida Mannosylierung
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Initialreaktion der O-Glykosylierung sekretorischer Proteine an Serin- oder Threonin-Resten wird bei Pilzen durch die Protein-O-Mannosyltransferasen (Pmt) katalysiert. In dem humanpathogenen Pilz Candida albicans wurden fünf Pmt-Isoformen (Pmt1, 2, 4, 5 und 6) charakterisiert, die essentiell für die Pathogenität des Pilzes sind. Da Pmt-Proteine in der Hefe Saccharomyces cerevisiae und höheren Eukaryoten Homo- und Heterodimere ausbilden, wurde in dieser Arbeit mit genetischen und biochemischen Methoden untersucht, ob C. albicans Pmt-Proteine ähnliche Dimere ausbilden, sowie weitere Proteinkomplexe mit anderen Interaktionspartnern eingehen. Das Split-Ubiquitin System in Hefe erlaubt eine genetische Interaktionsanalyse von Membranproteinen. Volllängen- und Kurzformen der Pmt-Isoformen wurden an Ubiquitin-Hälften (Nub, Cub) fusioniert und untereinander auf ihre Interaktion überprüft. Hierdurch konnten Homodimere der Pmt2-, Pmt4- und Pmt6-Isoformen nachgewiesen werden. Die Bildung der homodimeren Komplexe aus Pmt2p und Pmt6p war unerwartet, da diese bei der Hefe S. cerevisiae nicht auftritt. Das Homodimer von Pmt6p aus C. albicans ließ sich durch den Austausch eines hoch konservierten Arginins (R178) erheblich schwächen, während die Deletion der katalytischen Domäne keine Auswirkungen auf der Pmt6-Pmt6-Interaktion hatte. Zum biochemischen Nachweis von Pmt-Interaktionen wurden C. albicans-Stämme konstruiert, die Pmt1p- und Pmt2p-Fusionen an verschiedene Antigen-Epitope enthalten. Zunächst wurde nachgewiesen, dass Epitop-Fusionen zumindest teilweise funktionell sind und ihre perinukleäre Lokalisation bestätigte die erwartete ER-Membranständigkeit. Durch paarweise Epitop-Markierungen der Pmt-Proteine und Koimmunopräzipitation konnte anschließend das Homodimer aus Pmt2p-Monomeren bestätigt werden, zusätzlich aber auch eine Interaktion zwischen Pmt1p und Pmt2p. Der fehlende Nachweis dieses Heterodimers im Split-Ubiquitin- System kann möglicherweise durch sterische Gründe oder das Fehlen der C-terminalen Pmt-Region erklärt werden. Auf Grundlage des Split-Ubiquitin Systems wurde nach noch unbekannten Interaktionspartnern der Pmt6-Isoform gesucht. Hierfür wurde zunächst eine C. albicans genomische Bank in einem Nub-Vektor konstruiert, die dann auf die Interaktion mit einer Pmt6-Cub-Köderfusion untersucht wurde. Das Screening ergab mehrere Interaktoren, unter anderem wie erwartet Pmt6p. Zusätzlich wurde mehrfach ein durch die Bankkonstruktion entstandenes, künstliches Protein identifiziert, das spezifisch mit Pmt6p interagierte. Überraschend wurde durch das Screening auch eine spezifische Interaktion zwischen der Pmt2-Isoform und dem Alg9-Protein nachgewiesen, welche eine Mannosyltransferase für die Reifung von N-Glykosylketten darstellt. Die Pmt2-Alg9-Interaktion wurde durch Koimmunopräzipitation verifiziert. Die Interaktion von Pmt2p mit Alg9p ist ein erster Hinweis auf eine funktionelle Verbindung zwischen N- und O-Proteinglykosylierung in Eukaryonten. The initial reaction of the O-glycosylation of secretory proteins in fungi is catalysed by the protein-O-mannosyltransferases (Pmt proteins). In the human pathogenic fungus Candida albicans five Pmt isoforms have been characterized (Pmt1, 2, 4, 5 and 6), which are essential for its virulence. In the yeast Saccharomyces cerevisiae and higher eukaryots Pmt proteins form homo- and heterodimers. In this thesis dimer formation of the Pmt isoforms in C. albicans was investigated by genetic and biochemical methods. In addition complex formation of the Pmt proteins with other, novel interaction partners was investigated. The split-ubiquitin system in yeast is useful for genetic interaction analyses of membrane proteins. A full length protein as well as a short version of the Pmt isoforms were fused to the ubiquitin halves (Nub and Cub) and these fusion proteins were tested for interactions. Using this method homodimer formation of the Pmt2, Pmt4 and Pmt6 isoforms was established. Formation of the homodimeric complex of Pmt2p and Pmt6p was unexpected, because this had not been observed in the yeast S. cerevisiae. The homodimer formation of Pmt6p in C. albicans was weakend after exchanging a highly conserved arginine residue (R179), while the deletion of the catalytic domain of Pmt6p had no effect on the Pmt6-Pmt6 interaction. In a biochemical approach C. albicans strains were constructed containing different antigen-epitops fused to Pmt1p and Pmt2p. These fusion proteins were at least partially functional and their perinuclear localization confirmed the expected localisation in the ER-membrane. By co-immunoprecipitation the homodimer formation of Pmt2p was verified. In addition, heterodimer formation of Pmt1p and Pmt2p was established. The absence of this heterodimer formation in the split-ubiquitin system can possibly be explained by steric hindrance or by lack of the C-terminal region of Pmt proteins. Using the split-ubiquitin system the genome of C. albicans was screened for further interaction partners of Pmt6p. For this purpose a genomic library was constructed into a Nub-vector and the Pmt6 Cub-vector was used as a bait plasmid. The screening revealed several of interactor proteins including Pmt6p as expected. Repeatedly, a small artificial protein originating from the bank construction was identified, which interacted specifically with Pmt6p. Surprisingly, the screening also revealed an interaction between Pmt2p and Alg9p, which was confirmed by co-immunoprecipitation. Alg9p is involved in N-glycosylation and its interaction with Pmt2p is a first hint for a functional linkage of protein O- and N-glycosylation.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	21.01.2008
Dateien geändert am:	21.01.2008
Promotionsantrag am:	23.11.2007
Datum der Promotion:	18.12.2007