Dokument: Erhöhung der Bereitstellung von NADPH in der Ganzzell-Biotransformation und Entwicklung eines neuen Biosensors
| Titel: | Erhöhung der Bereitstellung von NADPH in der Ganzzell-Biotransformation und Entwicklung eines neuen Biosensors | |||||||
| Weiterer Titel: | Increasing the NADPH supply for whole-cell biotransformation and development of a novel biosensor | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=26847 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20130927-095931-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | M.Sc. Siedler, Solvej [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Dr. Bringer, Stephanie [Betreuer/Doktorvater] [im Online-Personal- und -Vorlesungsverzeichnis LSF anzeigen] Prof. Dr. Bott, Michael [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Whole-cell biotransformation, NADPH biosensor, enzyme evolution, single-cell analysis, FACS | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Pentosephosphat Weg (PPP) als NADPH Quelle für reduktive Ganzzell-Biotransformationen mit Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum untersucht. Die Reduktion von Methylacetoacetat (MAA) zu dem chiralen (R)-Methyl-hydroxybutyrat (MHB) diente als Modellreaktion und wurde von der Alkohol Dehydrogenase (ADH) aus Lactobacillus brevis katalysiert. Die partielle Zyklisierung des PPP in E. coli und C. glutamicum konnte durch die Deletion der Phosphofructokinase Gens (pfkA) erreicht werden; diese Deletion verhindert den Abbau von Fructose-6-Phosphat über die Glykolyse. Expression des Gens der ADH aus L. brevis in der ∆pfkA Mutante führte in der Biotransformation zu einer zweifachen Steigerung des Verhältnisses von MHB-pro-Glucose. Eine 13C-Flussanalyse validierte die partielle Zyklisierung des PPP in E. coli, da der Nettofluss durch die Phosphoglucose Isomerase in gluconeogenetischer Richtung erfolgte. Außerdem zeigte sich, dass kein Fluss durch die Pyruvatkinase in der ∆pfkA Mutanten vorhanden war. Dieses lässt darauf schließen, dass die Verfügbarkeit von Phosphoenolpyruvat (PEP) in der ∆pfkA Mutante limitiert ist, was zu einer geringeren Glucose Aufnahme mittels des Phosphotransferase Systems (PTS) führt. Eine PTS-unabhängige Glucose Aufnahme und Phosphorylierung wurde durch die heterologe Expression eines Glucose Facilitators und einer Glucosekinase aus Zymomonas moblis erreicht und führte in der E. coli ∆pfkA Mutante zu einer Erhöhung der spezifischen Biotransformationsgeschwindigkeit um 21%. Die Deletion des Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase Gens (gapA) kann theoretisch zu einer vollständigen Zyklisierung des PPP und einer Ausbeute von 12 mol NADPH pro mol Glucose-6-Phosphat führen. Mit einer C. glutamicum gapA Deletionsmutante wurde die höchste bisher beschriebene Ausbeute von 7,9 mol MHB pro mol Glucose erreicht.
In dem zweiten Teil dieser Doktorarbeit wurde ein Redox Sensor entwickelt, der niedrige intrazelluläre NADPH/NAD+ Verhältnisse detektiert und die Synthese eines Autofluoreszenzproteins induziert. DNA-Microarray Analysen von E. coli während der Biotransformation zeigten eine Erhöhung der Transkription des Gens von SoxS nach Zugabe von MAA. Dies wies darauf hin, dass der Regulator des soxS Gens SoxR durch die Absenkung des NADPH/NADP+ Verhältnisses aktiviert wird. Der soxS Promotor wurde mit dem Gen des gelb fluoreszierenden Proteins (eYFP) auf einem Plasmid fusioniert. Dieses Plasmid wurde in E. coli eingebracht wonach die Bakterienzellen fluoreszierten, wenn MAA zu der Kultur gegeben wurde. Die maximale Fluoreszenzintensität und somit die maximale eYFP Konzentration korrelierte mit der Dauer der Absenkung des NADPH/NADP+ Redox-Verhältnisses, die durch die Zugabe von verschiedene MAA Konzentrationen variiert wurde. Weiterhin hing die Kinetik des Fluoreszenzanstiegs von der ADH-Aktivität ab, die die Kinetik der MAA Reduktion und der Absenkung des NADPH/NADP+ Verhältnisses bestimmt. Mittels dieses Biosensors konnten mutagenisierte ADH-Bibliotheken mit dem unnatürlichen Substrat 4-Methyl-2-Pentanon (MP) untersucht werden. Einzelne Zellen dieser Bibliothek, die eine erhöhte Fluoreszenz in Anwesenheit von MP zeigten, wurden über Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ausgewählt. Dabei wurde eine Mutante mit einer um 35% gesteigerten spezifischen MP-Reduktionsrate im Vergleich zur Wildtyp-ADH isoliert. Dieser Sensor eröffnet somit die Möglichkeit, NADPH abhängige Enzyme mittels Hoch-Durchsatz Screenings zu evolvieren.In the first part of this work, the pentose phosphate pathway (PPP) was investigated as a source of NADPH in reductive whole-cell biotransformation using Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum as hosts and glucose as reductant. The reduction of methyl acetoacetate to the chiral (R)-methyl hydroxybutyrate (MHB) served as a model reaction for NADPH-dependent reactions and was catalyzed by an alcohol dehydrogenase (ADH) from Lactobacillus brevis. Partial cyclization of the PPP in E. coli and C. glutamicum was achieved by deletion of the phosphofructokinase gene pfkA, which prevents fructose 6-phosphate catabolism in the glycolytic pathway. The pfkA-deficient mutants carrying the L. brevis ADH showed a doubled MHB-per-glucose ratio compared to the parent strains. In E. coli the partial PPP cyclization in the ∆pfkA mutant was proven by 13C-flux analysis, which showed a negative net flux through the phosphoglucose isomerase reaction. Furthermore, the flux through pyruvate kinase was found to be absent in the ∆pfkA mutant, indicating that a low phosphoenolpyruvate (PEP) concentration limited glucose uptake via the phosphotransferase system (PTS). PTS-independent glucose uptake and phosphorylation via the glucose facilitator and glucose kinase from Zymomonas mobilis enhanced the specific MHB productivity by 21% in the E. coli ∆pfkA mutant. Deletion of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (gapA) theoretically results in a completely cyclized PPP and a ratio of 12 mol NADPH per mol glucose 6-phosphate. A C. glutamicum ∆gapA mutant showed a ratio of 7.9 mol MHB per mol glucose, which is the highest one reported so far. Formation of the by-product glycerol presumably was responsible for not achieving a higher ratio. In the second part of this work, a biosensor was developed which is capable of detecting a lowered intracellular NADPH/NADP+ ratio and trigger the synthesis of an autofluorescent protein. DNA microarray analysis of E. coli during biotransformation showed an upregulation of soxS transcription after MAA addition, suggesting that the SoxR regulator known to upregulate soxS expression is activated by a lowered NADPH/NADP+ ratio. Subsequently, the soxS promoter was fused on a plasmid with the gene encoding yellow fluorescent protein (eYFP). E. coli transformed with this plasmid showed fluorescence when MAA was added to the culture. The final fluorescence intensity and thus the final eYFP titer correlated with the period of a lowered NADPH/NADP+ ratio, which was varied by adding different amounts of MAA. Furthermore, the kinetics of the fluorescence increase was dependent on the ADH activity, which determines the kinetics of MAA reduction and thus the kinetics of the decline of the NADPH/NADP+ ratio. The biosensor was used to screen a library of ADH mutants with the non-natural substrate 4-methyl-2-pentanone (MP). Single cells of the library showing increased fluorescence in the presence of MP were isolated using fluorescence-activated cell sorting (FACS). One of the isolated ADH mutants was shown to have a 35% higher specific MP reduction activity than the wild-type ADH, which demonstrates the applicability of this sensor in the development of NADPH-dependent enzymes. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 27.09.2013 | |||||||
| Dateien geändert am: | 27.09.2013 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 06.09.2012 | |||||||
| Datum der Promotion: | 18.12.2012 |
