Dokument: Posttranslationale Modifikationen von Histonen aus humanem Lebergewebe: Deiminierung von Arginin und Razemisierung von Asparaginsäure

Titel:	Posttranslationale Modifikationen von Histonen aus humanem Lebergewebe: Deiminierung von Arginin und Razemisierung von Asparaginsäure
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28204
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140127-115829-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Biol. Reckert, Alexandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,93 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.01.2014 / geändert 26.01.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Ritz-Timme, Stefanie [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Histone zeigen eine Vielzahl posttranslationaler Proteinmodifikationen, die von großer Bedeutung für Struktur und Funktion der Proteine sind. In der Literatur gibt es umfangreiches Datenmaterial zu den Histonmodifikationen, die dem epigenetischen Histon-Code zugeordnet werden (insbesondere Acetylierung und Methylierung). Weniger Daten gibt es zu der offenbar irreversiblen Deiminierung von Arg-Resten, deren biologische Folgen noch nicht vollständig verstanden sind. Noch weniger Daten gibt es zu den spontanen, nicht enzymatischen Modifikationen, insbesondere zu der Deamidierung von Asn-Resten und der Razemisierung von Asp-Resten, die allerdings als funktionell bedeutsame Altersveränderungen der Histone angesprochen wurden. Fast alle publizierten Daten zu posttranslationalen Histonmodifikationen wurden bislang an Zellkulturmaterial erhoben, sodass unklar ist ob die beschriebenen Modifikationen auch unter in-vivo-Bedingungen vorliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese Erkenntnislücken durch Nachweis der einschlägigen posttranslationalen Histonmodifikationen an in-vivo-gealtertem Gewebe zu schließen. Der Arbeit lagen folgende Arbeitshypothesen zugrunde: (1) Humane Histone zeigen auch intra vitam eine alters- und/oder umweltbedingte Akkumulation (spontaner) posttranslationaler Aminosäurenmodifikationen, hierbei besonders an Asparagin-, Asparaginsäureresten sowie Argininresten (Bildung von Citrullinresten). (2) Diese verändern die Struktur sowie die physikochemischen Eigenschaften der Moleküle und können so die enzymatische Vermittlung des Histon-Codes und damit die Transkriptionskontrolle stören. Zusammenfassend wurde dazu folgendes Prozedere gewählt: - Aufreinigung der Histone aus in vivo gealterten Zellen (autoptisch entnommenes Lebergewebe) - Bestimmung des Razemisierungsgrades der Asx-Reste in den aufgereinigten Histonen; Prüfung des Zusammenhangs zwischen Lebensalter und dem D-Asp-Reste-Gehalt der Proben - Bestimmung des Deiminierunggrades der Arg-Reste in den aufgereinigten Histonen; Prüfung des Zusammenhangs zwischen Lebensalter und dem Citrullingehalt der Proben - Massenspektrometrische Lokalisation deamdierter Asn-Reste, deiminierter Arg-Reste und der dem Histon-Code zugerechneten Modifikationen - Auswertung und Interpretation der resultierenden „Modifikationskarte“. Hypothese (1) wurde insoweit bestätigt, dass eine Akkumulation von D-Asx für die Histone H1 (bis 8,7 %) und H2B (bis 7 %) belegt werden konnte, die allerdings nicht mit dem Lebensalter korrelierte. Die Akkumulation dieser spontanen Modifikationen belegt eine gewisse Langlebigkeit der Histone, die aber dennoch einem Turnover zu unterliegen scheinen. Weiter wurde eine relevante Deiminierung von Argininresten festgestellt, insbesondere in den Histonen H2A (bis 11 %), H2B (bis 14,6 %) und H1 (bis 10,4 %); Citrullinreste in H2B und H1 werden hier für Histone aus humanem Lebergewebe erstmalig beschrieben. Die Deiminierung der Argininreste wird enzymatisch vermittelt. Dabei wird sie teils dem Histon-Code zugerechnet, teils wird von einer Induktion im Rahmen zellulären Stresses (Apoptose, Zelltod) ausgegangen. Hohe Deiminierungsraten der Arg-Reste sowie die Deamidierung von Asn-Resten und Asp-Resten sollen die Moleküle destabilisieren bzw. zur Denaturierung führen; insoweit könnten diese Modifikationen auch die Eliminierung „alter“ Histone einleiten. Auch die Detektion einiger Histon-Code-Modifikationen an den Histonen aus postmortal entnommenem Lebergewebe war erfolgreich, so konnten einige in der Literatur an Zellkulturen beschriebene Acetylierungen und Methylierungen auch an Histonen aus Lebergewebe belegt werden. Propionylierungsstellen an Histon H1 konnten hier sogar erstmalig gezeigt werden; auch sie könnten dem Histon-Code zugeordnet werden, zu dieser Modifikation ist allerdings noch wenig bekannt. Hypothese (2) ist unter Berücksichtigung der einschlägigen Literatur zu bejahen. Der Einfluss der Deamidierung von Asn-Resten, der Razemisierung von Asp-Resten und der Deiminierung von Arg-Resten auf Struktur und Ladung der Moleküle dürfte dadurch sicher auch Einfluss auf ihre Funktionalität bei der Vermittlung des epigenetischen Codes haben. Allerdings gelang in der vorliegenden Arbeit weder die massenspektrometrische Lokalisation deamidierter Asn-Reste noch deiminierter Argininreste in vivo entstandener Modifikationen als jeweils erster Schritt zur Klärung der Frage der biologischen Folgen der Modifikationen, da diese Modifikationen nicht in genügend hohen Konzentrationen in den Proben vorlagen. Eine weitere Eingrenzung der tatsächlich von Deamidierung betroffenen Asparaginreste sowie der von Deiminierung betroffenen Argininreste wäre unter anderem durch Generierung und Nutzung sequenzspezifischer Antikörper in diversen Immunologischen Ansätzen denkbar, auch über ein Bioinformatik gestütztes „modeling“ der potentiell betroffenen Sequenzbereiche. Für die Detektion der Deiminierungsstellen wäre ein weiterer Massenspektrometrie-basierter Ansatz möglich, über eine selektive Anreicherung deiminierter Peptide nach Modifikation mit 4-Hydroxyphenylglyoxal. Histone proteins show lots of posttranslational modifications that are essential for structure and function of proteins. Lots of data on histone modifications have been published regarding the “histone-code” (especially acetylation and methylation). There is less data on the possibly irreversible deimination of arg residues whose biological consequences are not jet understood. Even less data is available on spontaneous, non enzymatic modifications like deamidation of asn residues or racemization of asp residues. However, some authors consider them to be functionally important alterations of histones during the aging process. Nearly all data on Histone modifications where collected by performing cell-culture-experiments and it is not yet clear if all of those modifications also occur in vivo. The aim of this study was to fill this gap of knowledge by detecting posttranslational Histone modification in in vivo aged tissue. The following hypotheses formed the basis of the study: • Human histones show intra vitam age- and environmental dependent accumulation of (spontaneous) posttranslational modification of amino acids, especially in asn, asp and arg residues (formation to citrulline) • These modifications alter structure and physicochemical features of the molecules and may interfere with the histone code and by doing so disturb the transcriptional regulation. In summary the following procedure was chosen: - Purification of histones out of in vivo aged human liver tissue (removed during autopsy) - Determination of the extent of aspartic acid racemization in purified histones; evaluation of a correlation between age and extend of D-asp-content - Determination oft the extent of deimination in purified histones investigation of a correlation between Age and extend of D-asp-content - Mass spectrometric localization of deamidated asn residues, deiminated arg residues and posttranslational histone code modifications - Analysis and interpretation of the resulting „modification map” Hypothesis (1) an accumulation of D-asx could be confirmed for histones H1 and H2B. No age-correlation was observed. The accumulation confirmed certain longevity of histones, but however there seems to be a protein turnover. In addition, an accumulation of deiminated arg residues has been detected for H1 (10,4%), H2B (14,6%) and H2A (11 %). This is the first time that deiminated arg residues have been detected in Histones H1 and H2B of human liver tissue. Deiminination is an enzymatic modification partly assigned to the histone code, partly assigned to cellular stress (apoptosis, cell-death). It is assumed that high rates of deimination or deamidation lead to a destabilization of protein structure or even denaturation of affected molecules. Therefore those modifications might even initiate the elimination of “old” histones. Furthermore some certain acetylation and methylation sites that have been detected in cell-cultures could also be detected in histones of human liver tissue. Propiolylation has been detected within Histone H1 for the first time. It is considered to be part of the histone code too, however, there is too little knowledge concerning this modification to be sure. Considering existing literature data, hypothesis (2) has been confirmed. The influence of deamidation, racemization and deimination on structure and charge of molecules can be considered to have also an effect on histone code modifications. Due to a low extend of modified peptides in the samples it was not possible do detect affected amino acid residues in mass spectrometric analysis as the first step in evaluating the biological consequences of this modifications. It might be possible to identify affected amino acids by creating sequence dependent antibodies for usage in an immunological approach, or by enriching of affected arg residues by modifying them with 4-hydroxyphenylglyoxal. Furthermore a bioinformatical approach involving modeling of potential affected sequences might be promising.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Rechtsmedizin
Dokument erstellt am:	27.01.2014
Dateien geändert am:	27.01.2014
Promotionsantrag am:	18.11.2013
Datum der Promotion:	08.01.2014