PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Die fortschreitende Entwicklung in der Gentherapie führt zu einem immer höheren Bedarf an therapeutisch einsetzbarer Plasmid DNA (pDNA). Zunächst war das Hauptziel der Gentherapie die Behandlung monogenetischer Erkrankungen und Infektionskrankheiten, bis Herz-Kreislauf-Erkrankungen und vor allem Krebs in den Fokus der Forschung rückten. Plasmid-DNA ist als nicht-viraler Vektor für den Transfer therapeutischer Gene geeignet und ist vor allem auch auf dem Gebiet der genetischen Impfung von Interesse. Gegenüber herkömmlichen Vakzinen bietet Plasmid-DNA den Vorteil, dass der Erreger nicht direkt in den Körper gelangt, sondern lediglich die genetische Information eines Antigens, deren Expression im Körper eine zelluläre oder humorale Immunantwort auslöst. Plasmide kommen in Bakterienzellen und anderen Mikroorganismen vor. Die Replikation findet unabhängig von der Wirts-DNA statt. Die kodierten Gene bieten beispielsweise durch Antibiotikaresistenz einen Selektionsvorteil für den Wirtsorganismus. Modifizierte Plasmide sind als Klonierungsvektoren für die molekulare Biologie und Biotechnologie von Bedeutung. Um Plasmid-DNA in ausreichenden Mengen herstellen zu können, sind effiziente und gut skalierbare Prozesse notwendig. Für den Einsatz im gentherapeutischen Bereich werden hohe Qualitätsanforderungen gestellt. Diesbezüglich müssen die Anforderungen regulatorischer Behörden (Food and Drug Administration, FDA/ European Medicines Agency, EMEA) eingehalten werden. Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNA bestehen aus der Kultivierung der plasmidreplizierenden Bakterien, einem Zellaufschluss zur Freisetzung der Plasmide und im Anschluss daran geeigneten Aufarbeitungsprozessen. Die bioverfahrenstechnische Herausforderung besteht in der Abtrennung der superspiralisierten Plasmid-DNA von strukturell ähnlichen Verunreinigungen wie RNA, chromosomaler DNA (chrDNA) und Lipopolysacchariden (LPS). In der Regel werden zur Aufreinigung von Plasmid-DNA chromatographische Verfahren eingesetzt. Die meisten dieser Methoden sind zeitaufwändig, mit hohen Produktverlusten verbunden oder es bestehen Schwierigkeiten in der Maßstabsvergrößerung. Eine Alternative stellen Extraktionsprozesse dar, da diese gut skalierbar sind und lediglich einfache und kostengünstige Chemikalien und Geräte benötigt werden. Es können sowohl wässrige als auch inversmizellare Zweiphasensystemen zur Aufarbeitung von Plasmid-DNA eingesetzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von Nukleinsäuren in einem inversmizellaren Zweiphasensystem untersucht. Es wurde der Einfluss verschiedener Salze und Salzkonzentrationen sowie die Auswirkung unterschiedlicher Alkohole auf das Extraktionssystem betrachtet. Im Fokus der Untersuchungen stand die Trennleistung des Systems. Darüber hinaus wurde die Kapazität und die Möglichkeit zur Trennung verschiedener Plasmidformen geprüft. Die Ergebnisse konnten erfolgreich eingesetzt werden, um RNA, Proteine, chromosomale DNA und Endotoxine während der Extraktion der Plasmid-DNA aus einem konditionierten bakteriellen Klarlysat abzureichern.