PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Exportierte bakterielle Proteine können aufgrund ihrer extrazellulären Lokalisation eine wichtige Rolle in der Entwicklung einer Bakterien-­‐Pflanzen-­‐Interaktion übernehmen. Um die potentiellen Faktoren, die an der Interaktion zwischen dem phytopathogenen Bakterium Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis und seiner Wirtspflanze Tomate beteiligt sind, zu identifizieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit mittels 2D-­‐Gelelektrophorese und MALDI-­‐TOF-­‐MS umfangreiche Exoproteomanalysen der ins Aussenmedium sekretierten Proteine (dem Exoproteom) von Cmm durchgeführt. Unter allen untersuchten Bedingungen wurden insgesamt 150 verschiedene Proteine identifiziert. Die Analyse der Aminosäuresequenzen dieser Proteine mit Hilfe verschiedener computergestützter Vorhersageprogramme, zeigte bei 52% (78 Proteine) die Präsenz eines Signalpeptides. Die restlichen 48% (73 Proteine) besitzen kein Signalpeptid, es handelt sich um intrazelluläre Proteine, die entweder über Zelllyse oder über noch unbekannte Sekretionsmechanismen nach außen gelangten. Die Analyse des Exoproteoms von Cmm in M9-­‐Minimalmedium, das Glukose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, führte zur Identifizierung zahlreicher extrazellulärer Proteine, unter denen sich mehrere bereits bekannte Virulenzfaktoren (CelA, Pat-­‐1, PpaC, ChpC), aber auch vermutete Virulenzfaktoren (Ppa-­‐Familie: PpaB1/B2, C, D, E, F, G, H, I, J; Chp-­‐Familie: ChpE; Subtilasen-­‐Familie: SbtB, C) befinden, die alle in hohen Mengen sekretiert wurden und für die eine Beteiligung an der Phytopathogenität des Bakteriums angenommen wird. Von den extrazellulären Enzymen, die pflanzliche Zellwandpolymere abbauen können, konnten neben der Cellulase (CelA), eine Xylanase (XysA), die Polygalakturonase (PgaA) und eine der beiden putativen Endoglukanasen (EndY) nachgewiesen werden. Bei mehreren Proteinen (CelA, SbtC, mehrere Ppa-­‐Serinpeptidasen) wurden aufgrund der teilweise starken Abweichung der tatsächlichen von den vorhergesagten Werten für den isoelektrischen Punkt und/oder Molekulargewicht, Anzeichen für eine Prozessierung gefunden. Die vergleichenden Analysen der Exoproteome von Cmm in verschiedenen Medien führten zu dem Ergebnis, dass die Supplementierung des M9-­‐Minimalmediums mit Xylemsaft/Tomatenblatthomogenat aus nicht infizierten Pflanzen zur Induktion von extrazellulären für die pathogene Interaktion relevanten Proteinen nicht benötigt wird. Auch die Zugabe von Zuckerpolymeren, die Bestandteile der pflanzlichen Zellwand darstellen, hatte keinen induzierenden Effekt auf die Synthese dieser Zuckerpolymere-­‐abbauenden Enzyme. Die vergleichenden Exoproteomanalysen in M9-­‐Minimalmedium und Vollmedium zeigten dagegen, dass die in M9-­‐Minimalmedium hoch induzierten Virulenzfaktoren in Vollmedium reprimiert sind und die Zugabe von Glukose weder Induktion noch Repression dieser Virulenzfaktoren hervorruft.Um die Rolle der Zellwandpolymere-­‐abbauenden Enzyme in der Virulenz zu überprüfen, wurden in den zwei Xylanasen (XysA, XysB), eine Polygalakturonase (PgaA), eine Cellulase (CelB) und zwei Endoglukanasen (EndX, EndY) kodierenden Genen „Knock out“-­‐Mutanten hergestellt. Mit Ausnahme der endX-­‐ und endXY-­‐Mutanten, die zu einem verzögerten Auftreten der Welke führten, hatte keine dieser Mutanten Auswirkung auf die Pathogenität. Zuletzt konnte für beide Xylanasen (XysA und XysB) über Agarplattentests und Zymogramme eine Xylanaseaktivität nachgewiesen werden. Die Sec-­‐ und Tat-­‐Systeme wurden in Cmm als zwei generelle Proteintransportsysteme identifiziert, die eine Signalpeptid-­‐abhängige Sekretion extrazellulärer Proteine in die Umgebung der Zelle vermitteln. Um die Rolle dieser Systeme für die Proteinsekretion allgemein und für die Sekretion von Virulenzfaktoren zu bestimmen, wurden das secG-­‐Gen und das tatB-­‐Gen durch die Insertion einer Antibiotikaresistenzkassette inaktiviert. Beide Gene kodieren Komponenten, die am Aufbau der Translokationspore beteiligt sind. Die Inaktivierung des secG-­‐Gens und auch des tatB-­‐Gens hatte einen Wachstumsdefekt der Mutanten auf Minimal-­‐ und Vollmedium zur Folge. Der Vergleich der Exoproteome der Sekretionsmutanten und des Wildtyps NCPPB382 ergab, dass die Mutation des secG-­‐Gens zu einer reduzierten Sekretionsrate mehrerer Proteine führte, während die Zusammensetzung des Exoproteoms unverändert blieb. Im Gegensatz dazu bewirkte die Mutation des tatB-­‐ Gens eine vollständige Blockade in der Sekretion von zwei Proteinen (NagA und CMM_0338). Folglich scheint die SecG-­‐Komponente für die Funktionalität der Sec-­‐ Translokase nicht essentiell zu sein, aber deren Effizienz zu erhöhen. Das TatB-­‐Protein stellt dagegen eine essentielle Komponente der Tat-­‐Translokase dar. In planta zeigten beide Mutanten einen avirulenten Phänotyp, sie waren nicht mehr in der Lage, die Pflanzen erfolgreich zu kolonisieren und Krankheitssymptome auszulösen. Allerdings lässt sich die Avirulenz der Sekretionsmutanten nicht durch die beobachteten Veränderungen des Exoproteoms erklären, so dass in Zukunft das Membran-­‐ und das Zellwandproteom untersucht werden sollten, um weitere über die Sec-­‐/Tat-­‐Systeme translozierte Proteine zu identifizieren, die Zellhüllen-­‐gebunden sind, aber für die Virulenz wichtige Funktionen besitzen könnten.