PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Die neuen sec-Gene secD und secF aus Corynebacterium glutamicum wurden isoliert und analysiert. C. glutamicum secD besteht aus 1911 bp und beginnt vermutlich mit dem seltenen Startcodon TTG. Das Protein wird aus 637 Aminosäuren gebildet (MW 67,7 kDa), weist sechs Transmembrandomänen und einen extracytoplasmatischen "Loop" von 371 Aminosäureresten auf und zeigt sechs konservierte Sequenzmotive unbekannter Funktion. C. glutamicum secF besteht aus 1209 bp, beginnt fünf Basen nach dem secD Stoppcodon und seine Shine-Dalgarno Sequenz ist Teil des secD 3'Ende. Das Protein besteht aus 403 Aminosäureresten (MW 43,7 kDa), zeigt ebenfalls sechs Transmembrandomänen und einen extracytoplasmatischen "Loop" von 95 Aminosäureresten sowie vier konservierte Sequenzmotive. Beide Proteine sind in ihren transmembranen Bereichen konserviert und im extracytoplasmatischen Loop variabel. Die bereits beschriebenen Gene secA, secY, secE und secG wurden mitsamt umliegenden Bereichen isoliert und sequenziert. Eine Analyse ergab, dass alle sec-Gene mit Ausnahme von secG in Nachbarschaft von Genen der Translation und Transkription angeordnet sind. Mutationsstudien zeigten, dass eine Mutation allein bei den Genen secD, secF und secG möglich ist. Alle Mutanten zeigen Störungen im Zellwandaufbau, was sich in Vergrößerung der Zellen für secD- und secF-Mutanten und erhöhter Empfindlichkeit für Detergenzien für secG-Mutanten äußert. Zur Analyse der Proteinsekretion in C. glutamicum wurde ein auf der Sekretion einer heterologen [alpha]-Amylase aus Streptomyces griseus basierendes, chromosomal- oder Plasmid-kodiertes Testsystem konstruiert. Amylase sekretierende C. glutamicum-Stämme können auf Stärke als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Eine Analyse der sec-Mutanten ergab, dass die Amylase-Sekretion in secG-Mutanten um fast 80 v.H. reduziert ist, während sie in secD- und secF-Mutanten vollständig unterbunden wird. Während die Überexpression einzelner sec-Gene keinen signifikanten Einfluss auf die Rate der Amylase-Sekretion ausübt, wird sie durch Überexpression von Kombinationen von sec-Genen deutlich gesteigert. Gemeinsame Überexpression von secD und secF steigern die Sekretion des heterologen Proteins um den Faktor 1,6, die Kombinationen von secE, secD und secF und secY, secD und secF erhöhen die Sekretionsrate um den Faktor 2,3 beziehungsweise 2,6.