PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Die Hauptfunktion von cAMP in eukaryontischen Zellen ist die Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase A (PKA). Bei geringen intrazellulären cAMP-Konzentrationen liegen die katalytischen Untereinheiten von PKA (C-Untereinheiten) inaktiv an die regulatorischen Untereinheiten (R-Untereinheiten) im Cytoplasma gebunden vor. Steigt der cAMP-Spiegel in der Zelle an, so dissoziieren die C-Untereinheiten von den sie inhibierenden R-Untereinheiten. Die dadurch aktivierten C-Untereinheiten können sowohl Substrate im Cytoplasma als auch, nach Translokation in den Kern, nukleäre Substrate phosphorylieren. Die Translokation der aktivierten C-Untereinheit in den Kern war Thema dieser Arbeit. In der Literatur wird Diffusion als Translokationsmodus angegeben. Der Export aus dem Kern erfolgt zusätzlich aktiv, vermittelt durch den physiologischen Inhibitor der Proteinkinase (PKI). Weitere Untersuchungen zeigen allerdings eine Abhängigkeit der Verteilung der aktivierten C-Untereinheit von posttranslationalen Modifikationen. Diese Beobachtungen lassen sich mit der in der Literatur beschriebenen Diffusion als Importmodus der C-Untereinheit nicht ausreichend erklären, da man bei freier Diffusion eine Gleichverteilung der Probe erwartet. Um zu überprüfen, nach welchem Mechanismus eine Verteilung der C-Untereinheiten erfolgt, bei der man Akkumulation im Kern und modifikationsabhängige Verteilungsunterschiede beobachtet, wurden Mikroinjektionsexperimente und Import-Assays an permeabilisierten Zellen mit fluoreszenzmarkierten Proben durchgeführt. Eine Quantifizierung der Fluoreszenzverteilungen zwischen Kern und Cytoplasma erfolgte über digitale Fluoreszenzmikroskopie. Die in dieser Arbeit durchgeführten umfangreichen Untersuchungen bestätigen eine Kern-Cytoplasma-Translokation der C-Untereinheit über Diffusion. Die C-Untereinheit wird darüber hinaus aktiv aus dem Kern exportiert. Das Translokationsmodell konnte durch neue Befunde erweitert werden. Die Verteilung der aktivierten C-Untereinheit scheint maßgeblich von Bindungsstellen im Cytoplasma und vor allem im Kern bestimmt zu werden, die das Enzym dem Verteilungsgleichgewicht entziehen. Das erklärt die beobachtete Akkumulation der C-Untereinheit im Kern. Durch Vergleich des Translokationsverhaltens der C-Untereinheit mit dem anderer Proteine konnte gezeigt werden, dass bestimmte diffusible Moleküle durch experimentelle Eingriffe in den aktiven Transport ebenfalls am Kerneintritt gehindert werden. Dies trifft auf Moleküle zu, deren Größe knapp unterhalb der Kernausschlussgrenze für Diffusion liegt. Kleinere diffusible Moleküle sind davon nicht betroffen. Mögliche Gründe dieses Unterschieds wurden diskutiert. Da die Aktivität der PKA im Kern durch deren nukleäre Präsenz bestimmt wird, trägt ein tieferer Einblick in den Diffusionsmechanismus von Molekülen durch die Kernporenkomplexe auch zum Verständnis der Regulation der cAMP-abhängigen Signaltransduktionswege bei.