PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Der elektroporative Transfer von DNA und anderen bioaktiven Substanzen durch Zellmembranen mittels elektrischer Pulse gewinnt zunehmend an Bedeutung in den neuen Disziplinen der Elektrochemotherapie und Elektrogentherapie. Die Effektivität des Elektrotransfers hängt wesentlich von der Adsorption der Gen-DNA und der Oligonucleotide an die Plasmazellmembran ab. Hier wird gezeigt, dass die Adsorption von längeren Oligonucleotiden, wie zum Beispiel ultraschall-behandelte Kalbs-Thymus DNA-Fragmente im Größenbereich von zirka 300 Basenparen an Lipidvesikel mit einem Durchmesser von [Phi] = 300 ± 90 nm durch divalente Kationen, wie z.B. Ca2+-Ionen, wesentlich verstärkt ist. Durch Zentrifugation werden freie und gebundene DNA bei der Wellenlänge [lambda] = 260 nm optisch bestimmt. Mittels Atom-Absorptionsspektrometrie (AAS) und mit Hilfe des Ca2+-Indikators Arsenazo-III werden die Dissoziationsgleichgewichtskonstanten sowohl der individuellen Binärkomplexe von Ca2+ und DNA-Bindung: Ca2+/Vesikel, DNA/Vesikel und Ca2+/DNA als auch die der drei verschiedenen Prozesse bestimmt, die zu dem Ternärkomplex: Ca2+/DNA/Vesikel führen. Die Turbiditätsrelaxationen der Vesikelsuspension bei der Wellenlänge [lambda] = 365 nm in äußeren elektrischen Feldern mit Feldstärken von E / (kV/cm) = 30 und 40 und der Pulsdauer tE = 10 µs deuten an, dass die Elektroelongationen der Vesikel mit der Glättung der thermischen Ondulationen, Ausdehnung der Membran und bei höheren Feldstärken E >= 40 kV/cm auch mit der Elektroporation gekoppelt sind. Die quantitative Analyse der Ausdehnungskinetik zeigt, dass die DNA-Adsorption an die Vesikeloberfläche als Ternärkomplex DNA/Ca/Lipide die Membran weicher macht und damit die Elektroporation erleichtert. Mit der Kenntnis aller Gleichgewichtskonstanten der Teilreaktionen der Entstehung des Ternärkomplexes und dem Verhalten des Ternärkomplexes DNA/Ca/Lipidvesikel in äußeren elektrischen Feldern kann man nun zielgerichtet die DNA-Adsorption für den elektroporativen Gentransfer, auch in der Elektrogentherapie, optimieren.

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The electroporative transfer of gene DNA and other bioactive substances into tissue cells by electric pulses gains increasing importance in the new disciplines of electrochemotherapy and electrogenetherapy. The efficiency of the electrotransfer depends crucially on the adsorption of the gene DNA and oligonucleotides to the plasma cell membranes. Here it is shown that the adsorption of larger oligonucleotides such as fragments (ca. 300 bp) of sonicated calf-thymus DNA, to anionic lipids of unilamellar vesicles (diameter [Phi] = 300 ± 90 nm) is greatly enhanced by divalent cations such as Ca2+ ions. Applying centrifugation, bound and free DNA are monitored optically at the wavelength [lambda] = 260 nm. Using arsenazo III as a Ca2+ indicator and atomic absorption spectroscopy (AAS), Ca2+ titrations of DNA and vesicles yield the individual equilibrium constants of Ca2+ and DNA binding not only for the binary complexes: Ca/lipids, Ca/DNA and DNA/lipids, respectively, but also for the various processes to form the ternary complex DNA/Ca/lipids. - The data provide the basis for goal-directed optimization protocols for the adsorption and thus efficient electrotransfer of oligonucleotides and polynucleotides into cells. The turbidity relaxations of the vesicle suspension at the wavelength [lambda] = 365 nm in the electric fields E / (kV/cm) = 30, 40 and the pulse duration tE = 10 µs indicate that the electroelongations of the vesicles are coupled to smoothing of membrane thermal undulations, membrane stretching and, at higher fields, to membrane electroporation. The quantitative analysis of the elongation kinetics suggests that the DNA adsorption to the vesicle surface (as ternary DNA/Ca/lipid complexes) renders the membrane more flexible and prone for potential electroporation.