Universität zu Köln

Schönefuß, Alexander (2012). Role of melanoma-derived ADAM-9 for invasion and metastasis of melanoma. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The protein ADAM-9 (A disintegrin and metalloprotease-9) belongs to the family of the ADAM proteases, which are type I transmembrane proteins and are unique among transmembrane proteins as they exhibit protease as well as adhesive functions. The ADAM proteases are involved in ectodomain shedding of membrane-bound molecules as well as in cell-cell and cell-matrix interactions. In human melanoma ADAM-9 is located at the tumor-stroma border in the stromal cells, but also in the melanoma cells. The aim of this work was to find out the function of ADAM-9, produced by the melanoma cells, for the development and invasion of melanoma. In vitro experiments, in which high invasive melanoma cells with stable down-regulation of ADAM-9 mediated via shRNA were used, showed that silencing of ADAM-9 slightly increased melanoma cell proliferation and remarkably reduced basement membrane penetration in an in vivo like invasion system. The reduced invasion through the basement membrane might be due to decreased adhesion to the basement membrane, as the ADAM-9 down-regulated cells exhibited significantly reduced adhesion towards type IV collagen and matrigel. Additionally it was found that the laminin β3-chain, which is a component of the basement membrane protein laminin 332, was cleaved by ADAM-9 in the N-terminal region. This work further confirmed that extracellular IL-1α down-regulates ADAM-9 expression in melanoma cells, which is mediated via a JNK dependent pathway and showed that in melanoma cells intracellularly active IL-1α controls constitutive expression levels of ADAM-9 via the involvement of ERK. Despite the activity of IL-1α as regulator of ADAM-9 expression, also indirubins, which are anti-cancer drugs, were identified as molecules down-regulating ADAM-9 expression in high invasive melanoma cells, but not in fibroblasts. To analyze if ADAM-9 also influences melanoma development and invasion in vivo, HGF/CDKR24C/R24C animals, which spontaneously develop melanomas as well as upon DMBA treatment, were crossbred with ADAM-9-/- mice. This strategy enabled to investigate melanoma development and progression in the absence of ADAM-9 in stromal as well as in the tumor cells. The created Adam-9mutated/ko (Adam-9-/-//Hgf/Cdk4R24C/R24C) animals developed more tumors compared to control (Adam-9+/+//Hgf/Cdk4R24C/R24C) mice at week four after DMBA treatment, whereas from week six onwards the Adam-9mutated/ko animals exhibited a reduced tumor number. This finding it most likely attributed to a differential proliferation of the tumor cells at both analyzed time-points. Interestingly lung metastases formation was significantly reduced in the Adam-9mutated/ko mice. This might be attributed to an impaired extravasation generated by a decreased adhesion of ADAM-9 deficient melanoma cells to endothelial cells, because it could be shown that ADAM-9 down-regulated melanoma cells exhibited a significantly reduced adhesion towards endothelial cells. Additionally the intravasation might also be reduced indicated by immunohistochemical stainings for laminin β3-chain. This staining was confined to the basement membrane zone and appeared continuous in the tumors obtained from the Adam-9mutated/ko animals, whereas in the control animals the basement membrane appeared destructed and discontinuous. This indicates that in the absence of ADAM-9 break down of the basement membrane by the melanoma cells might be reduced resulting in decreased intravasation. To summarize the in vitro and in vivo data, melanoma-derived ADAM-9 is involved in basement penetration and melanoma metastases formation in the lungs. The obtained data suggest that ADAM-9 can contribute to lung metastases formation by facilitating basement membrane penetration and mediating adhesion of melanoma cells to endothelial cells.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Das Protein ADAM-9 (A disintegrin and metalloprotease-9) ist ein Mitglied der Familie der ADAM Proteasen, welche zur Klasse der Typ I Transmembranproteine gehören und als einzige Transmembranproteine eine Funktion als Protease sowie als Adhäsionsmolekül ausüben. ADAM Proteasen sind beteiligt an der Prozessierung von membrangebundenen Proteinen (ectodomain shedding) sowie an Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen. In histologischen Färbungen von humanen Melanomen ist ADAM-9 an der Stroma-Tumor Grenze, sowohl in stromalen Zellen als auch in Melanomzellen, nachgewiesen worden. Das Ziel dieser Arbeit war es die Beteiligung von ADAM-9, das in Melanomzellen produziert wird, an der Melanomentstehung und -invasion herauszufinden. In in vitro Experimenten mit hoch invasiven Melanomzellen, in welchen die ADAM-9 Expression mittels shRNA stabil herunterreguliert wurde, zeigte sich dass die Herunterregulation von ADAM-9 die Proliferation von Melanomzellen leicht erhöht und die Invasion der Zellen durch die Basalmembran stark verringert. Ein Grund für die reduzierte Basalmembraninvasion könnte eine verringerte Adhäsion der ADAM-9 herrunterregulierten Melanomzellen auf der Basalmembran sein, da diese Zellen eine signifikant reduzierte Adhäsion gegenüber Typ IV Kollagen sowie Matrigel aufwiesen. Außerdem wurde gezeigt, dass die Laminin β3-Kette, welche ein Bestandteil des Basalmembranproteins Laminin 332 ist, von ADAM-9 in ihrem N-terminalen Ende proteolytisch geschnitten werden kann. Des Weiteren konnte durch diese Arbeit bestätigt werden, dass extrazelluläres IL-1α die Expression von ADAM-9 in Melanomzellen, unter der Beteiligung von JNK, herrunterregulieren kann und dass in Melanomzellen intrazellulär aktives IL-1α die konstitutive Expression von ADAM-9 durch einen ERK abhängigen Signalweg kontrolliert. Außer der Aktivität von IL-1α als Regulator der ADAM-9 Expression, konnten zudem Indirubine, welche in der Krebstherapie eingesetzt werden, als Moleküle identifiziert werden, welche die ADAM-9 Expression in hoch invasiven Melanomzellen, aber nicht in Fibroblasten reduzieren. Um die Beteiligung von ADAM-9 an der Melanomentstehung und -invasion in der in vivo Situation zu analysieren, wurden HGF/CDKR24C/R24C Mäuse, welche sowohl spontan als auch nach DMBA Behandlung Melanome entwickeln, mit ADAM-9-/- Mäusen gekreuzt. Diese Strategie ermöglichte es die Melanomentstehung und -progression in einer Situation, in der sowohl die Stroma-, als auch die Tumorzellen kein ADAM-9 exprimieren, zu untersuchen. Die generierten Adam-9-/-//Hgf/Cdk4R24C/R24C Tiere wiesen vier Wochen nach der DMBA Behandlung zunächst mehr Tumore im Vergleich zu Adam-9+/+//Hgf/Cdk4R24C/R24C Kontrolltieren auf ab Woche sechs hingegen entwickelten die Adam-9-/-//Hgf/Cdk4R24C/R24C Tiere weniger Tumore. Dieses Ergebnis könnte auf eine unterschiedliche Proliferation der Tumorzellen zu beiden untersuchten Zeitpunkten zurückzuführen sein. Interessanterweise entwickelten die Adam-9-/-//Hgf/Cdk4R24C/R24C Mäuse signifikant weniger Lungenmetastasen als die Adam-9+/+//Hgf/Cdk4R24C/R24C Tiere. Dieser Effekt könnte auf eine gestörte Extravasation zurückzuführen sein, da gezeigt werden konnte, dass die Adhäsion von Melanomzellen, in denen ADAM-9 herrunterreguliert wurde, gegenüber Endothelzellen signifikant reduziert ist. Zusätzlich könnte auch die Intravasation reduziert sein, da in immunhistochemischen Färbungen der Tumore gegen die Laminin β3-Kette, die Färbung in den Adam-9-/-//Hgf/Cdk4R24C/R24C Tieren eine intakte und kontinuierliche Basalmembran zeigte. In den Adam-9+/+//Hgf/Cdk4R24C/R24C Tieren hingegen war die Basalmembran degradiert und diskontinuierlich. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass in ADAM-9 defizienten Tieren die Degradierung der Basalmembran durch die Melanomzellen vermindert sein könnte, was zu einer reduzierten Intravasation führt. Zusammenfassend haben die in vitro und in vivo Daten gezeigt, dass von Melanomzellen produziertes ADAM-9 an der Basalmembraninvasion und der Entstehung von Lungenmetastasen beteiligt ist. Die erhaltenen Ergebnisse lassen vermuten, dass ADAM-9 in der Überwindung der Basalmembran durch Melanomzellen eine Rolle spielt und in der Lage ist Adhäsion zwischen Melanom- und Endothelzellen zu vermitteln. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schönefuß, Alexander a.schoenefuss@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-48579
Date:	3 May 2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language melanoma, ADAM-9, protase UNSPECIFIED
Date of oral exam:	18 June 2012
Referee:	Name Academic Title Nischt, Roswitha PD Dr. Hammerschmidt, Matthias Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4857