Optimierung der Aufreinigung und Rekonstitution von humanem P-Glykoprotein in <em>S. cerevisiae </em>zur Charakterisierung neuer Modulatoren

Abstract

P-Gp ist eine ca. 170 kDa großes Protein, das aus zwei homologen Hälften besteht. Jede homologe Hälfte enthält jeweils sechs a-Helix transmembranäre Domainen und eine Nukleotid-Bindungsstelle im Zytoplasma. Für P-Gp werden mehrere Bindungsstellen postuliert. Es existieren zumindest eine H- und eine R-Bindungsstelle. Unklar ist es, ob sich alle Bindungsstellen innerhalb einer großen Bindungstasche befinden, oder ob sie über den gesamten Bereich des Proteins verstreut sind. Zur Aufklärung werden unter anderem funktionelle Assays (ATPase und Calcein), Mutations- und Photoaffinitäts-Labeling-Studien durchgeführt. Um diese Studien zur Struktur-Wirkungsaufklärung direkt an homogenem Protein durchführen zu können, benötigt man ein rekombinantes Expressionssystem. <br /> In dieser Arbeit wurde das aus der Literatur bekannte Expressionssystem für P-Gp in dem Protease-defizienten S. cerevisiae Stamm BJ5457 unter der Kontrolle des Promotors PMA1 etabliert und modifiziert. Die zur Rekonstitution verwendeten Lipide beinflussen die spezifische Aktivität von P-Gp. Eine aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylsäure und Cholesterol bestehende Lipidmischung zeigte in den Untersuchungen das höchste Verhältnis zwischen basaler und stimulierter ATPase Aktivität (Messfenster). Daher wurde diese Lipidmischung als neue Standardmischung für alle weitergehenden Untersuchungen verwendet. Desweiteren wurde das P-Gp in extrudierte Liposomen rekonstituiert. Das P-Gp richtet sich hierbei bevorzugt mit der ATP-Bindungsstelle nach außen aus. Weiter wurden zwei bzw. fünf zusätzliche Histidine am C-Terminus des Proteins angefügt, um die Affinität für Nickel-Beads zu erhöhen, damit die Ausbeute an reinem Protein erhöht wird. Die Affinitätserhöhung zu den Nickel-Beads konnte zwar bei dem 15-Histidin markiertem Protein nachgewiesen werden, aber das resultierende homogene P-Gp zeigte nur eine geringe spezifische Aktivität. Die cDNA von P-Gp unter der Kontrolle des Promotors PMA1 in Ergosterol-defiziente Stämme kloniert. Der Stamm JS3 ERG2-4, mit vorwiegendem Zymosterol-Anteil, hat eine Expressionsrate von 8,16% ± 2,09%. Der Stamm JS6 ERG6, mit überwiegend Fecosterol-Anteil, hat eine Expressionsrate von 14,7 ± 1,23%. Das P-Gp ist in der Hefemembran mit veränderter Lipidordnung und –fluidität funktionell exprimiert und kann aus beiden Stämmen funktionell aufgereinigt werden. Die mit diesem System erzielten Expressionsraten sind die bisher höchsten. Das mit Octylglucosid aufgereinigte Protein aus den Ergosterol-defizienten Stämmen ist zu 100% aktiv. Die Vorteile des in dieser Arbeit entwickelten Expressionssystem für P-Gp kann auch für die Expression anderer ABC-Transporter in Hefen genutzt werden.<br /> Der zweite Teil dieser Arbeit lieferte Erkenntnisse über die Stimulation der ATPase Aktivität durch bekannte und neue Modulatoren basierend auf der Tariquidar-Struktur. In den Untersuchungen konnte erstmals für den Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib eine Wechselwirkung mit der ATP-Bindungsstelle am aufgereinigten Protein gezeigt werden. Bei geringen Konzentrationen von Imatinib (pEC50-Wert von 4,74 ± 0,30) wird die Affinität von ATP zu der Nukleotid-Bindungsstelle von P-Gp vermindert. Ebenfalls konnte für Hoechst, ein spezifisches Substrat der H-Seite, eine Affinitätserhöhung für Rhodamin 123, ein spezifisches Substrat der R-Seite, gezeigt werden. Daraus lässt sich schließen, dass die beiden Bindungsstellen in positiver Regulation miteinander wechselwirken. Der Vergleich der durch den ATPase-Assay bestimmten Affinitätsdaten mit den Affinitätsdaten aus den Calcein-AM-Assay und Daunorubicin-Influx-Assay mittels einer Hauptkomponentenanalyse zeigte für einen homogenen WK-X Datensatz keine Korrelation. <br /> Weiterhin wurden die WK-X-Verbindungen auf Ihre physiko-chemischen Eigenschaften durch pKa und log P-Wert Bestimmung untersucht, da diese Faktoren bei Interaktion von Modulatoren mit der Lipidmembran eine Rolle spielen. Eine Korrelation der P-Gp Affinitätsdaten und der log P-Werte konnte in keinem Fall gezeigt werden. Es bestand allerdings eine Korrelation zwischen den jeweiligen log P und log Pion Werten.