Aufbau von DNA-Nanoarchitekturen mittels funktionalisierter DNA-Bausteine

Abstract

Es existiert ein wachsendes Interesse an neuen Materialien und Methoden, die für den „Bottom-up“-Ansatz zur Erzeugung von höher geordneten zwei- und dreidimensionalen Strukturen im Nanometermaßstab geeignet sind. Nucleinsäuren sind als leicht zugängliches, einfach zu replizierendes biologisches Material sehr gut als Bausteine für solche Strukturen geeignet. Das logische Grundprinzip der spezifischen Basenpaarung erlaubt die Programmierung von Strukturinformationen in den strukturgebenden Baustein selbst. Mit den vielfältigen, etablierten Möglichkeiten der synthetischen und biochemischen Manipulation und Amplifikation von Nucleinsäuren und Nucleotiden, stehen eine Reihe von Werkzeugen zur Verfügung, um maßgeschneiderte Makromoleküle und Nanoarchitekturen für diverse Anwendungen zu erzeugen.<br /> Im Rahmen dieser Dissertation sollte neben der Watson-Crick-Basenpaarung eine weitere strukturgebende Wechselwirkungsmöglichkeit in DNA eingebracht werden. Durch Funktionalisierung von Nucleinsäuren an ihren Untereinheiten, den Nucleotiden, wurde DNA zu einer zusätzlichen, von der Basenpaarung unabhängigen, nicht-kovalenten Interaktionsmöglichkeit befähigt.<br /> In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode etabliert, mit deren Hilfe die gezielte Funktionalisierung makromolekularer DNA-Bausteine – in diesem Falle DNA-Miniringe (Minicircle) - zur Herstellung von höheren, DNA-basierten Aggregaten gelingt. Die funktionalisierten DNA-Miniringe konnten mittels Rasterkraftmikroskopie in situ abgebildet werden; und Aggregate von zusammenhängenden DNA-Ringen wurden nachgewiesen. Die in diesem Projekt eingeführte Funktionalisierung ist der Interkalator Anthracen, der die DNA-Minicircle befähigt mit anderen doppelsträngigen DNA-Bausteinen zu aggregieren und so eine, zur Watson/Crick-Hybridisierung orthogonale, nicht-kovalente Wechselwirkungsmöglichkeit von DNA-Nanoobjekten ermöglicht. Der Interkalator Anthracen wurde zunächst erfolgreich durch chemische Synthese über einen flexiblen Linker-Arm an die C5-Position der Nucleobase eines 2´-Desoxyuridin-Derivats geknüpft, in ein Phosphoramidit überführt und mittels DNA-Festphasensynthese in verschiedene Sequenzen kurzer Oligonucleotide eingebaut. Diese 21 bp kurzen Oligonucleotide, die ein bis drei Anthracen-modifizierte Nucleoside enthielten, können an beliebige makromolekular DNA-Bausteine mit entsprechenden komplementären Einzelstrangsequenzen hybridisieren und diese so mit der Interkalator-Funktionaliät ausstatten.<br /> Auf der Basis von DNA-Minicircle wurden funktionalisierbare DNA-Miniring-Konstrukte mit eben solchen, zu den funktionalisierten Oligonucleotiden komplementären, Einzelstrangregionen hergestellt, die als DNA-Nanoobjekte rasterkraftmikroskopisch untersucht werden konnten.

<strong>Assembly of higher order DNA-Nanoarchitectures via functionalized DNA</strong><br /> The programmable self-association of molecular units into higher ordered structures plays a key role in the bottom-up construction of nanomaterials. Crucial for the successful supramolecular assembly of nanoobjects, however, is the choice of the functional molecular units themselves. Nucleic acids have emerged as a convenient target for these purposes because of their unique properties in molecular recognition and the ease by which oligonucleotides can be accessed synthetically. Nucleic acids provide a bottom-up approach for the assembly of higher order nano-scale structures using the rationale of distinct base-pairing and sequence specificity which allows for programming the desired structure information onto the building blocks itself.<br /> The double helical arrangement of two complementary oligonuclotide molecules to a linear helix axis, linear in the topological sense of being unbranched, can be overcome by introducing branching points like has been done with holliday junctions. With the ability of incorporating chemical modifications into DNA strands via the use of base-modified nucleoside phosphoramidites, an additional capacity of interaction and branching can be introduced to the building block DNA independent of Watson/Crick basepairing. <br /> This work focuses on preparation of a intercalator modified nucleoside phosphoramidite, the incorporation into ds DNA and the identification and characterization of the products as well as their ability to form higher order structures via atomic force microscopy (AFM). An anthracene derivative was attached to the C5 position of the nucleobase of a 2´-deoxyuridine-derivativ via a flexible linker-arm by chemical synthesis and converted into a phosphoramidite as a modified dT substrate for DNA solidphase synthesis.<br /> Seven functionalized 21mer DNA-oligonucleotides were then synthesized by automated DNA solidphase synthesis, containing either one, two or three modified dT nucleotides in their sequence . The modification consists of a simple commercially readily available anthracene derivative which possesses an electron rich and planar structure which is suitable as a DNA intercalator Suitable detectable nano-objects which, upon interaction with the synthesized intercalator-modified DNA form aggregates or clusters were found in so called DNA minicircles where literature gives examples for visualizing such specimen on a liquid/surface interface via AFM and describes the properties and generation of such DNA elements.<br /> An appropriate design for the DNA minicircle precursors was established based on A-tract sequences with the addition of a 21bp region with a custom sequence. Such DNA minicircles were generated with and without a single strand gap region at the 21bp custom sequence. Complementary anthracene-functionalized DNA single strands were hybridized to this DNA minicircles and the resulting aggregates were visualized by AFM.