Funktionelle Untersuchungen des ABC-Transporters Breast Cancer Resistance Protein (BCRP)

Abstract

Die Multidrug Resistenz (MDR) von Krebszellen stellt ein bedeutendes Problem bei der Behandlung von Tumoren mit Chemotherapeutika dar. Vor allem die Expression der drei ABC-Transporter P-gp (ABCB1), MRP1 (ABCC1) und BCRP (ABCG2) spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der MDR. Als membranständige Effluxpumpen nutzen diese Transportproteine die durch ATP Hydrolyse freigesetzte Energie, um Substanzen entgegen eines Konzentrationsgradienten aus den Zellen hinaus zu transportieren. Bei Krebszellen führt dies zu einer Verringerung der intrazellulären Zytostatikakonzentration und in Folge zum Versagen der Chemotherapie. Sowohl die Hemmung der Effluxpumpen mit spezifischen hoch affinen Modulatoren als auch die Inhibition von Schlüsselsignaltransduktionskaskaden, die die Genregulation der Transporter beeinflussen, stellen mögliche Ansatzpunkte dar, die Entwicklung der Transporter-basieren MDR zu bekämpfen.<br /> Im Fokus dieser Arbeit steht die funktionelle Untersuchung des ABC-Transporters BCRP. Um ein besseres Verständnis der Funktionsweise von BCRP zu erlangen, wurden unterschiedliche zellbasierte Akkumulations-Assays entwickelt, etabliert oder bereits bestehende modifiziert und angewendet, um die Interaktion von bekannten und neuen Modulatoren mit BCRP näher zu charakterisieren. Mit Hilfe dieser Testsysteme wurden diverse im Arbeitskreis synthetisierte Tariquidar-Analoga (WK-Verbindungen) bezüglich ihrer Hemmwirkung gegenüber BCRP untersucht. Durch den Vergleich der erhaltenen Aktivitätswerte an BCRP mit denen an P-gp wurden Strukturmerkmale identifiziert, welche die Interaktion mit P-gp und/oder BCRP hervorrufen. Für 30 WK-Modulatoren wurden 2D- und 3D-Struktur-Wirkungsbeziehungen abgeleitet. Dabei konnten CoMFA- und CoMSIA-Modelle erstellt werden, die eine gute Vorhersage der biologischen Aktivitätswerte ermöglichen. <br /> In dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass auch Verbindungen, die ein geringes Molekulargewicht besitzen und teilweise nicht-basisch sind, zu einer bemerkenswerten Hemmung von ABCG2 führen. Im Zuge dieser Untersuchungen wurde eine neue Klasse spezifischer BCRP Modulatoren mit geringer Toxizität identifiziert. Die Resultate dieser Untersuchungen liefern essentielle Ideen für die zielgerichtete Synthese weiterer strukturell ähnlicher spezifischer BCRP Inhibitoren. <br /> Die Interaktion von Tyrosinkinaseinhibitoren mit BCRP konnte erfolgreich näher charakterisiert werden. Es wurde demonstriert, dass die EGFR Inhibitoren Gefitinib und PD158780 und der PI3K/Akt Inhibitor LY294002 in der Lage sind, den Expressionsstatus von ABCG2 via PI3K/Akt-Signaltransduktionskaskade zu verringern. Zusätzlich kam es zu einer Internalisierung von BCRP. Die BCR-ABL Inhibitoren Imatinib und Nilotinib - Verbindungen, die nicht mit EGFR interagieren - zeigten keinen Einfluss auf den BCRP Expressionslevel. Mit Hilfe des Pheophorbid A-Assays konnte die verminderte BCRP Expression auch auf funktioneller Ebene nachgewiesen werden. Die Funktion des in der Plasmamembran exprimierten Proteins blieb dabei erhalten. Die Aktivität der PI3K/Akt-Signaltransduktionskaskade spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der BCRP Expression. <br /> Ein zentrales Motiv dieser Arbeit bestand in der Intention, potentielle Bindungsstellen von BCRP mit Hilfe der etablierten funktionellen Assays zu untersuchen und einen Einblick zu gewinnen, ob sich diese Bindungsstellen gegenseitig beeinflussen. Die Identifizierung der Interaktionsform von insgesamt 12 Verbindungen aus unterschiedlichen Substanzklassen konnte durch die Bestimmung der Hemmwirkung im Hoechst 33342- und im Pheophorbid A-Assay bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen erreicht werden. Auf Basis der aus diesen Untersuchungen gewonnenen Erkenntnisse wurde ein Modell über drei mögliche Bindungsstellen von BCRP erstellt, die sich gegenseitig, im Sinne einer positiven Kooperativität, beeinflussen.