Kitasatospora putterlickiae F18-98, ein neu isolierter Bakterienstamm aus der Rhizosphäre von Putterlickia verrucosaMolekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Aminohydroxybenzoesäure-Biosynthese
Kitasatospora putterlickiae F18-98, ein neu isolierter Bakterienstamm aus der Rhizosphäre von Putterlickia verrucosa
Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Aminohydroxybenzoesäure-Biosynthese
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DissertationDate of Exam
11.12.2003Date of Publication
2003Advisor
Leistner, EckhardCo-Referee
König, Gabriele M.Metadata
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Abstract
Maytansinoide Naturstoffe sind potente Verbindungen mit antineoplastischer Aktivität, die aus Höheren Pflanzen, Bakterien und aus Moosen isoliert wurden. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem biogenetischen Ursprung der Maytansinoide in Höheren Pflanzen.
In Putterlickia verrucosa-Zellkulturen wurde mittels PCR nach einem AHBA-Synthasegen gesucht. Dazu wurden degenerierte Oligonukleotide aus konservierten Bereichen bakterieller AHBA-Synthasegene abgeleitet und dem pflanzlichen Codongebrauch angepasst. Die Sequenzierung der verschiedenen PCR-Produkte und Southern Hybridisierungen ergaben keine Homologien zu bakteriellen AHBA-Synthasegenen. In Putterlickia verrucosa sind vermutlich keine Gene der Maytansinbiosynthese vorhanden. Dass Gene der Maytansinbiosynthese in einem Horizontaler Gentransfer zwischen Bakterien und Höheren Pflanzen übertragen wurden, ist damit unwahrscheinlich.
Die mikrobielle Besiedlung Maytansin führender Pflanzen wurde in vorherigen Arbeiten intensiv untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die 16S und die 16S-23S rDNA eines bakteriellen Isolates F18-98 aus der Rhizosphäre einer Maytansin führenden Putterlickia verrucosa-Pflanze sequenziert. Nach weiteren chemotaxonomischen Arbeiten von Groth et al. (2003) wurde der Stamm als die neue Art Kitasatospora putterlickiae F18-98 charakterisiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Sekundärstoffspektrum des Stammes K. putterlickiae im Hinblick auf eine mögliche Maytansinoid-Bildung untersucht. Dazu wurde der Stamm in verschiedenen Medien kultiviert und die radioaktiv markierte Vorstufe AHBA zugefügt. Nur bei einigen Kulturanzuchten wurde AHBA in Sekundärstoffe von K. putterlickiae eingebaut. Der stärkste Einbau wurde bei der Verwendung von M2-Glycerin-Medium beobachtet. K. putterlickiae unterliegt vermutlich einer Katabolitrepression. In der Ethylacetatphase wurden mehrere radioaktiv markierte Produkte nachgewiesen, die nicht Maytansin und Ansamitocin P3 sind. Die Strukturaufklärung dieser Verbindungen findet am HKI in Jena statt und ist noch nicht abgeschlossen.
Wie in einer Bioautographie mit Penicillium avellaneum gezeigt wurde, produzieren nur ältere Kulturen von K. putterlickiae Sekundärstoffe mit geringer antibiotischer Aktivität.
Mit Hilfe einer homologen AHBA-Synthasegen-Sonde wurde ein Gencluster mit einem AHBA-Synthasegen aus einer Cosmidbank von K. putterlickiae identifiziert. Das AHBA-Synthasegen wurde sequenziert, als Fusionsprotein in E. coli exprimiert und gereinigt. In einem Aktivitätstest katalysierte die AHBA-Synthase aus K. putterlickiae die Bildung von AHBA.
Durch Southern Hybridisierungen wurden alle weiteren Gene der AHBA-Biosynthese in K. putterlickiae detektiert. Ein Oxidoreduktase- und ein Phosphatasegen wurden vollständig sequenziert. Ein Gen für die Polyketidsynthase wurde in Teilen sequenziert. Das Gencluster zeigt deutliche Homologien zu anderen Ansamycin-Clustern. In Southern Hybridisierungen mit genomischer DNA von K. putterlickiae wurden Homologien zur Acyltransferase der Maytansinoid-Biosynthese gefunden. Aufgrund der molekularbiologischen Untersuchungen könnte es sich bei dem Stamm K. putterlickiae um einen möglichen Ansamycin-Produzenten handeln.
In weiteren Arbeiten wurden die Anfangsschritte der AHBA-Biosynthese in A. mediterranei untersucht, die von der Oxidoreduktase, der AHBA-Synthase und der Phosphatase katalysiert werden sollten. Es war bekannt, dass die Oxidoreduktase und die AHBA-Synthase interagieren. In dieser Arbeit wurden die Oxidoreduktase und die AHBA-Synthase in E. coli coexprimiert, aufgereinigt und die Aktivität bestimmt. Die in E. coli exprimierten Proteine waren inaktiv.
Da eine Überexpression der Oxidoreduktase, der AHBA-Synthase und der Phosphatase in S. lividans nicht gelang, wurde S. lividans mit dem Plasmid pHGF7604 transformiert. Das Plasmid enthält die AHBA-Biosynthesegene rifG-N aus A. mediterranei. Die Aktivität der Oxidoreduktase wurde im zellfreien Extrakt aus S. lividans/ (pHGF7604) bestimmt. UDP-Glucose wurde bei pH 7,5 spezifisch umgesetzt. Der KM-Wert lag bei 2,91 mM. Die Zugabe von Asparagin oder Aspartat steigerte die Oxidoreduktase-Aktivität. Die Aminosäuren sind Substrate der AHBA-Synthase, die auch eine Aminotransferase-Funktion besitzt. Die Funktionen der Oxidoreduktase und der AHBA-Synthase sind eng miteinander gekoppelt. Zellfreie Extrakte von Deletionsmutanten der Oxidoreduktase und der Phosphatase zeigten keine Enzymaktivität. Damit bilden die Oxidoreduktase, die AHBA-Synthase und die Phosphatase vermutlich einen Enzymkomplex, der UDP-Glucose zu Kanosamin umsetzt.
In Putterlickia verrucosa-Zellkulturen wurde mittels PCR nach einem AHBA-Synthasegen gesucht. Dazu wurden degenerierte Oligonukleotide aus konservierten Bereichen bakterieller AHBA-Synthasegene abgeleitet und dem pflanzlichen Codongebrauch angepasst. Die Sequenzierung der verschiedenen PCR-Produkte und Southern Hybridisierungen ergaben keine Homologien zu bakteriellen AHBA-Synthasegenen. In Putterlickia verrucosa sind vermutlich keine Gene der Maytansinbiosynthese vorhanden. Dass Gene der Maytansinbiosynthese in einem Horizontaler Gentransfer zwischen Bakterien und Höheren Pflanzen übertragen wurden, ist damit unwahrscheinlich.
Die mikrobielle Besiedlung Maytansin führender Pflanzen wurde in vorherigen Arbeiten intensiv untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die 16S und die 16S-23S rDNA eines bakteriellen Isolates F18-98 aus der Rhizosphäre einer Maytansin führenden Putterlickia verrucosa-Pflanze sequenziert. Nach weiteren chemotaxonomischen Arbeiten von Groth et al. (2003) wurde der Stamm als die neue Art Kitasatospora putterlickiae F18-98 charakterisiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Sekundärstoffspektrum des Stammes K. putterlickiae im Hinblick auf eine mögliche Maytansinoid-Bildung untersucht. Dazu wurde der Stamm in verschiedenen Medien kultiviert und die radioaktiv markierte Vorstufe AHBA zugefügt. Nur bei einigen Kulturanzuchten wurde AHBA in Sekundärstoffe von K. putterlickiae eingebaut. Der stärkste Einbau wurde bei der Verwendung von M2-Glycerin-Medium beobachtet. K. putterlickiae unterliegt vermutlich einer Katabolitrepression. In der Ethylacetatphase wurden mehrere radioaktiv markierte Produkte nachgewiesen, die nicht Maytansin und Ansamitocin P3 sind. Die Strukturaufklärung dieser Verbindungen findet am HKI in Jena statt und ist noch nicht abgeschlossen.
Wie in einer Bioautographie mit Penicillium avellaneum gezeigt wurde, produzieren nur ältere Kulturen von K. putterlickiae Sekundärstoffe mit geringer antibiotischer Aktivität.
Mit Hilfe einer homologen AHBA-Synthasegen-Sonde wurde ein Gencluster mit einem AHBA-Synthasegen aus einer Cosmidbank von K. putterlickiae identifiziert. Das AHBA-Synthasegen wurde sequenziert, als Fusionsprotein in E. coli exprimiert und gereinigt. In einem Aktivitätstest katalysierte die AHBA-Synthase aus K. putterlickiae die Bildung von AHBA.
Durch Southern Hybridisierungen wurden alle weiteren Gene der AHBA-Biosynthese in K. putterlickiae detektiert. Ein Oxidoreduktase- und ein Phosphatasegen wurden vollständig sequenziert. Ein Gen für die Polyketidsynthase wurde in Teilen sequenziert. Das Gencluster zeigt deutliche Homologien zu anderen Ansamycin-Clustern. In Southern Hybridisierungen mit genomischer DNA von K. putterlickiae wurden Homologien zur Acyltransferase der Maytansinoid-Biosynthese gefunden. Aufgrund der molekularbiologischen Untersuchungen könnte es sich bei dem Stamm K. putterlickiae um einen möglichen Ansamycin-Produzenten handeln.
In weiteren Arbeiten wurden die Anfangsschritte der AHBA-Biosynthese in A. mediterranei untersucht, die von der Oxidoreduktase, der AHBA-Synthase und der Phosphatase katalysiert werden sollten. Es war bekannt, dass die Oxidoreduktase und die AHBA-Synthase interagieren. In dieser Arbeit wurden die Oxidoreduktase und die AHBA-Synthase in E. coli coexprimiert, aufgereinigt und die Aktivität bestimmt. Die in E. coli exprimierten Proteine waren inaktiv.
Da eine Überexpression der Oxidoreduktase, der AHBA-Synthase und der Phosphatase in S. lividans nicht gelang, wurde S. lividans mit dem Plasmid pHGF7604 transformiert. Das Plasmid enthält die AHBA-Biosynthesegene rifG-N aus A. mediterranei. Die Aktivität der Oxidoreduktase wurde im zellfreien Extrakt aus S. lividans/ (pHGF7604) bestimmt. UDP-Glucose wurde bei pH 7,5 spezifisch umgesetzt. Der KM-Wert lag bei 2,91 mM. Die Zugabe von Asparagin oder Aspartat steigerte die Oxidoreduktase-Aktivität. Die Aminosäuren sind Substrate der AHBA-Synthase, die auch eine Aminotransferase-Funktion besitzt. Die Funktionen der Oxidoreduktase und der AHBA-Synthase sind eng miteinander gekoppelt. Zellfreie Extrakte von Deletionsmutanten der Oxidoreduktase und der Phosphatase zeigten keine Enzymaktivität. Damit bilden die Oxidoreduktase, die AHBA-Synthase und die Phosphatase vermutlich einen Enzymkomplex, der UDP-Glucose zu Kanosamin umsetzt.
Subjects
Kitosatospora, AHBA, Biosynthese
Classification (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieBoettcher, Theresa: Kitasatospora putterlickiae F18-98, ein neu isolierter Bakterienstamm aus der Rhizosphäre von Putterlickia verrucosa : Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Aminohydroxybenzoesäure-Biosynthese. - Bonn, 2003. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-02912
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-02912
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In Putterlickia verrucosa-Zellkulturen wurde mittels PCR nach einem AHBA-Synthasegen gesucht. Dazu wurden degenerierte Oligonukleotide aus konservierten Bereichen bakterieller AHBA-Synthasegene abgeleitet und dem pflanzlichen Codongebrauch angepasst. Die Sequenzierung der verschiedenen PCR-Produkte und Southern Hybridisierungen ergaben keine Homologien zu bakteriellen AHBA-Synthasegenen. In Putterlickia verrucosa sind vermutlich keine Gene der Maytansinbiosynthese vorhanden. Dass Gene der Maytansinbiosynthese in einem Horizontaler Gentransfer zwischen Bakterien und Höheren Pflanzen übertragen wurden, ist damit unwahrscheinlich.
Die mikrobielle Besiedlung Maytansin führender Pflanzen wurde in vorherigen Arbeiten intensiv untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die 16S und die 16S-23S rDNA eines bakteriellen Isolates F18-98 aus der Rhizosphäre einer Maytansin führenden Putterlickia verrucosa-Pflanze sequenziert. Nach weiteren chemotaxonomischen Arbeiten von Groth et al. (2003) wurde der Stamm als die neue Art Kitasatospora putterlickiae F18-98 charakterisiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Sekundärstoffspektrum des Stammes K. putterlickiae im Hinblick auf eine mögliche Maytansinoid-Bildung untersucht. Dazu wurde der Stamm in verschiedenen Medien kultiviert und die radioaktiv markierte Vorstufe AHBA zugefügt. Nur bei einigen Kulturanzuchten wurde AHBA in Sekundärstoffe von K. putterlickiae eingebaut. Der stärkste Einbau wurde bei der Verwendung von M2-Glycerin-Medium beobachtet. K. putterlickiae unterliegt vermutlich einer Katabolitrepression. In der Ethylacetatphase wurden mehrere radioaktiv markierte Produkte nachgewiesen, die nicht Maytansin und Ansamitocin P3 sind. Die Strukturaufklärung dieser Verbindungen findet am HKI in Jena statt und ist noch nicht abgeschlossen.
Wie in einer Bioautographie mit Penicillium avellaneum gezeigt wurde, produzieren nur ältere Kulturen von K. putterlickiae Sekundärstoffe mit geringer antibiotischer Aktivität.
Mit Hilfe einer homologen AHBA-Synthasegen-Sonde wurde ein Gencluster mit einem AHBA-Synthasegen aus einer Cosmidbank von K. putterlickiae identifiziert. Das AHBA-Synthasegen wurde sequenziert, als Fusionsprotein in E. coli exprimiert und gereinigt. In einem Aktivitätstest katalysierte die AHBA-Synthase aus K. putterlickiae die Bildung von AHBA.
Durch Southern Hybridisierungen wurden alle weiteren Gene der AHBA-Biosynthese in K. putterlickiae detektiert. Ein Oxidoreduktase- und ein Phosphatasegen wurden vollständig sequenziert. Ein Gen für die Polyketidsynthase wurde in Teilen sequenziert. Das Gencluster zeigt deutliche Homologien zu anderen Ansamycin-Clustern. In Southern Hybridisierungen mit genomischer DNA von K. putterlickiae wurden Homologien zur Acyltransferase der Maytansinoid-Biosynthese gefunden. Aufgrund der molekularbiologischen Untersuchungen könnte es sich bei dem Stamm K. putterlickiae um einen möglichen Ansamycin-Produzenten handeln.
In weiteren Arbeiten wurden die Anfangsschritte der AHBA-Biosynthese in A. mediterranei untersucht, die von der Oxidoreduktase, der AHBA-Synthase und der Phosphatase katalysiert werden sollten. Es war bekannt, dass die Oxidoreduktase und die AHBA-Synthase interagieren. In dieser Arbeit wurden die Oxidoreduktase und die AHBA-Synthase in E. coli coexprimiert, aufgereinigt und die Aktivität bestimmt. Die in E. coli exprimierten Proteine waren inaktiv.
Da eine Überexpression der Oxidoreduktase, der AHBA-Synthase und der Phosphatase in S. lividans nicht gelang, wurde S. lividans mit dem Plasmid pHGF7604 transformiert. Das Plasmid enthält die AHBA-Biosynthesegene rifG-N aus A. mediterranei. Die Aktivität der Oxidoreduktase wurde im zellfreien Extrakt aus S. lividans/ (pHGF7604) bestimmt. UDP-Glucose wurde bei pH 7,5 spezifisch umgesetzt. Der KM-Wert lag bei 2,91 mM. Die Zugabe von Asparagin oder Aspartat steigerte die Oxidoreduktase-Aktivität. Die Aminosäuren sind Substrate der AHBA-Synthase, die auch eine Aminotransferase-Funktion besitzt. Die Funktionen der Oxidoreduktase und der AHBA-Synthase sind eng miteinander gekoppelt. Zellfreie Extrakte von Deletionsmutanten der Oxidoreduktase und der Phosphatase zeigten keine Enzymaktivität. Damit bilden die Oxidoreduktase, die AHBA-Synthase und die Phosphatase vermutlich einen Enzymkomplex, der UDP-Glucose zu Kanosamin umsetzt.},
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In Putterlickia verrucosa-Zellkulturen wurde mittels PCR nach einem AHBA-Synthasegen gesucht. Dazu wurden degenerierte Oligonukleotide aus konservierten Bereichen bakterieller AHBA-Synthasegene abgeleitet und dem pflanzlichen Codongebrauch angepasst. Die Sequenzierung der verschiedenen PCR-Produkte und Southern Hybridisierungen ergaben keine Homologien zu bakteriellen AHBA-Synthasegenen. In Putterlickia verrucosa sind vermutlich keine Gene der Maytansinbiosynthese vorhanden. Dass Gene der Maytansinbiosynthese in einem Horizontaler Gentransfer zwischen Bakterien und Höheren Pflanzen übertragen wurden, ist damit unwahrscheinlich.
Die mikrobielle Besiedlung Maytansin führender Pflanzen wurde in vorherigen Arbeiten intensiv untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die 16S und die 16S-23S rDNA eines bakteriellen Isolates F18-98 aus der Rhizosphäre einer Maytansin führenden Putterlickia verrucosa-Pflanze sequenziert. Nach weiteren chemotaxonomischen Arbeiten von Groth et al. (2003) wurde der Stamm als die neue Art Kitasatospora putterlickiae F18-98 charakterisiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Sekundärstoffspektrum des Stammes K. putterlickiae im Hinblick auf eine mögliche Maytansinoid-Bildung untersucht. Dazu wurde der Stamm in verschiedenen Medien kultiviert und die radioaktiv markierte Vorstufe AHBA zugefügt. Nur bei einigen Kulturanzuchten wurde AHBA in Sekundärstoffe von K. putterlickiae eingebaut. Der stärkste Einbau wurde bei der Verwendung von M2-Glycerin-Medium beobachtet. K. putterlickiae unterliegt vermutlich einer Katabolitrepression. In der Ethylacetatphase wurden mehrere radioaktiv markierte Produkte nachgewiesen, die nicht Maytansin und Ansamitocin P3 sind. Die Strukturaufklärung dieser Verbindungen findet am HKI in Jena statt und ist noch nicht abgeschlossen.
Wie in einer Bioautographie mit Penicillium avellaneum gezeigt wurde, produzieren nur ältere Kulturen von K. putterlickiae Sekundärstoffe mit geringer antibiotischer Aktivität.
Mit Hilfe einer homologen AHBA-Synthasegen-Sonde wurde ein Gencluster mit einem AHBA-Synthasegen aus einer Cosmidbank von K. putterlickiae identifiziert. Das AHBA-Synthasegen wurde sequenziert, als Fusionsprotein in E. coli exprimiert und gereinigt. In einem Aktivitätstest katalysierte die AHBA-Synthase aus K. putterlickiae die Bildung von AHBA.
Durch Southern Hybridisierungen wurden alle weiteren Gene der AHBA-Biosynthese in K. putterlickiae detektiert. Ein Oxidoreduktase- und ein Phosphatasegen wurden vollständig sequenziert. Ein Gen für die Polyketidsynthase wurde in Teilen sequenziert. Das Gencluster zeigt deutliche Homologien zu anderen Ansamycin-Clustern. In Southern Hybridisierungen mit genomischer DNA von K. putterlickiae wurden Homologien zur Acyltransferase der Maytansinoid-Biosynthese gefunden. Aufgrund der molekularbiologischen Untersuchungen könnte es sich bei dem Stamm K. putterlickiae um einen möglichen Ansamycin-Produzenten handeln.
In weiteren Arbeiten wurden die Anfangsschritte der AHBA-Biosynthese in A. mediterranei untersucht, die von der Oxidoreduktase, der AHBA-Synthase und der Phosphatase katalysiert werden sollten. Es war bekannt, dass die Oxidoreduktase und die AHBA-Synthase interagieren. In dieser Arbeit wurden die Oxidoreduktase und die AHBA-Synthase in E. coli coexprimiert, aufgereinigt und die Aktivität bestimmt. Die in E. coli exprimierten Proteine waren inaktiv.
Da eine Überexpression der Oxidoreduktase, der AHBA-Synthase und der Phosphatase in S. lividans nicht gelang, wurde S. lividans mit dem Plasmid pHGF7604 transformiert. Das Plasmid enthält die AHBA-Biosynthesegene rifG-N aus A. mediterranei. Die Aktivität der Oxidoreduktase wurde im zellfreien Extrakt aus S. lividans/ (pHGF7604) bestimmt. UDP-Glucose wurde bei pH 7,5 spezifisch umgesetzt. Der KM-Wert lag bei 2,91 mM. Die Zugabe von Asparagin oder Aspartat steigerte die Oxidoreduktase-Aktivität. Die Aminosäuren sind Substrate der AHBA-Synthase, die auch eine Aminotransferase-Funktion besitzt. Die Funktionen der Oxidoreduktase und der AHBA-Synthase sind eng miteinander gekoppelt. Zellfreie Extrakte von Deletionsmutanten der Oxidoreduktase und der Phosphatase zeigten keine Enzymaktivität. Damit bilden die Oxidoreduktase, die AHBA-Synthase und die Phosphatase vermutlich einen Enzymkomplex, der UDP-Glucose zu Kanosamin umsetzt.},
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