Microarrayanalyse gynäkologischer Tumorentitäten

Abstract

<em>Softwareentwicklung</em> Die Analyse von Genexpressionsprofilen fällt nicht länger exklusiv in den Aufgabenbereich von Bioinformatik Experten. Jedoch gestaltet sich der Erhalt von statistisch signifikanten Resultaten schwierig und erfordert neben biologischem Hintergrundwissen auch weitreichende rechentechnische Fertigkeiten. In dieser Arbeit wird ein neues, anwenderfreundliches Microarray Reportingwerkzeug namens maRt vorgestellt [1]. Die Software bietet Zugang zu bioinformatischen Ressourcen, wie der Gen Ontologie und aktuellen biologischen Stoffwechselwegen durch den Zugriff auf die Datenbanken DAVID und BioMart. Die Ergebnisse werden in strukturierten HTML Reports zusammengefasst, wobei verschiedene Schichten an Informationen preisgegeben werden. In diesen Reports sind Inhalte aus diversen internetbasierenden Quellen integriert und verlinkt. Die Software zieht Nutzen aus der ubiquitären „multi-core“ Technologie moderner Arbeitsplatzrechner über parallele Datenverarbeitung. Aufgrund der RCP basierten internen Infrastruktur von maRt bietet die Software eine günstige Basis für die Entwicklung neuer R basierter Anwendungen. Verfügbarkeit: Routinen für die Installation unter diversen Betriebssystemen, Dokumentation und verschiedene Tutorien sind LGPL Lizenz basiert auf den Webseiten des Pharmazeutischen Instituts zu finden unter: <a href="http://www.pharma.uni-bonn.de/www/mart" target="_blank">http://www.pharma.uni-bonn.de/www/mart</a>. Die Software ist für akademische Zwecke frei zugänglich.<br /><em>Qualitätssicherung von Microarray Daten</em> Die Qualitätssicherung und die Verfahren zur Normalisierung von Microarray Daten nehmen einen hohen Stellenwert im Verlauf der Analyse von Genexpressionsprofilen ein. Gegenwärtig sind verschiedene Methoden verfügbar, die Qualitätserfassung von Microarray Datensets anbieten. Jedoch scheint keine Standardvisualisierung vorhanden zu sein, mit deren Hilfe auch individuelle Qualitätsparameter von Microarrays abgebildet werden können. In dieser Arbeit wird eine bequeme Methode präsentiert, die das Visualisieren von Standard Qualitätsparametern mit Circos ermöglichen [2]. Die Darstellung der verschiedenen Parameter und potentiellen Ausreißer ist zirkulär angeordnet, um so jedes einzelne Array eines Datensets visuell zu erfassen. Die vorgestellte Methode erbringt vielversprechende Resultate für die Mehrheit der öffentlich verfügbaren Datensets, welche häufig auf dem von Affymetrix lizenzierten Human Genome (GPL 96, GPL570 und GPL571) Formaten basieren. Zukünftig könnten die vorgeschlagenen Circos basierten Qualitätsabbilder als allgemeiner Standard in Datenbanken, die Genexpressionsdaten bereitstellen übernommen werden, um die rasche Erstbegutachtung der Microarraydatensets zu gewährleisten. <br /><em>Wirkstoffstudie</em> Kürzlich erst wurde in einer Studie berichtet, dass liposomales Cisplatin die Resistenz von ovariellen A2780cis Zellen überwindet [3]. In dieser Arbeit wurde gefunden, dass die zytotoxische Aktivität von liposomalem Cisplatin nicht an die DNA Platinierung dieser Zellen geknüpft ist. Diese Tatsache suggeriert, dass der Wirkmechanismus von liposomalem Cisplatin grundsätzlich verschieden von freiem Cisplatin ist. Um einen Einblick in die zugrundeliegenden Mechanismen zu erhalten, müssen Resistenz assoziierte Gensignaturen auf der Ebene des Transkriptoms von A2780 und A2780cis Zellen nach Behandlung mit IC50 Dosen an freiem und liposomalem Cisplatin analysiert werden. Eine Analyse der Prozessnetzwerke der deregulierten Gene bestätigte, dass liposomales Cisplatin ein signifikant unterschiedliches Transkriptionsmuster aufweist im Vergleich zu freiem Cisplatin. Der Tumorsupressor p53 ist ein Schlüsselgen in der differentiellen Transkription als Antwort auf freies bzw. liposomales Cisplatin. Freies Cisplatin induziert über die Aktivierung von p38 MAPK eine Vielzahl an Genen, die als Schlüsselgene im intrinsischen (Mitochondrialen) Apoptose Pathway agieren, z.B. BAX, BID, CASP9. Liposomales Cisplatin induziert jedoch Gene, die im extrinsischen Apoptoseweg partizipieren (TNFRSF10B– DR5, ,CD70-TNFSF7). Dieser Mechanismus ist entscheidend für die Fähigkeit liposomalen Cisplatins, um eine Überwindung der Cisplatinresistenz von A2780cis Zellen zu erzielen. Nach dem Zelleintritt beeinflusst der liposomale Wirkstoff die Aktivität von Cisplatin an den subzellulären Komponenten im Gegensatz zu freiem Cisplatin auf gravierende Wiese und verursacht daher eine komplexe Signalwirkung die in ein apoptotisches Szenario mündet. Dies wirft neues Licht auf die Ansätze, welche Liposomen als Wirkstoff-Transporter in der Krebstherapie einsetzen und suggeriert, dass liposomales Cisplatin eine vielversprechende Strategie in für die Behandlung von Cisplatinresistenten Ovarialkarzinomen. <br /><em>Tumor Progressionsstudie </em>Gegenwärtig sind keine allgemein akzeptierten Biomarker für die Charakterisierung von Zervixkarzinomen verfügbar. In dieser Arbeit wurde daher die Varianz-Komponenten Analyse [4] für die Detektion von Biomarkern eingesetzt. Die Methode wurde in dieser Arbeit auf Microarray Genexpressionsdaten aus vier öffentlich verfügbaren Zervixkarzinom Studien angewandt (n=126) [5]. Die wegbereitende Studie von Bachtiary et al. inspirierte zu der Annahme, dass sowohl intra Tumorals inter Stadien-Heterogenität die Zuverlässigkeit onkologischer Marker maßgeblich beeinflusst. Zielführend in der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung sowohl statistisch als auch klinisch relevanter Genexpressionsprofile von zervikalen Tumoren. Zusätzlich zur Varianz-Komponenten Analyse soll die so genannte „Gene Set Enrichment Analysis“ (GSEA) [6] für die weiterführende Untersuchung der erhaltenen Genexpressionsprofile verwendet werden. Insgesamt wurden 22.277 Gene mit der Varianz-Komponenten Analyse untersucht, elf Gene zeichnet eine besonders niedrige Variabilität aus, d.h. ihre intra Stadien Varianz lag im Verhältnis zur Gesamtvarianz (W/T) zwischen 0,18 und 0,38. Sieben dieser Proben waren in den verschiedenen Zervixkarzinom Stadien induziert, diese sind GINS1, PAK2, DTL, AURKA, PRKDC, NEK2 und CEP55. Die übrigen vier Gene sind nur in normalem Zerivix Gewebe exprimiert, diese sind P11, EMP1, UPK1A und HSPC159. Eine GSEA der 9.873 Gene, die ein W/T Verhältnis von unter 0,75 aufwiesen, ergab signifikant angereicherte Genexpressionssignaturen, welche auf eine Behandlung durch angiocidin und darapladib hinwiesen. Zusätzlich konnten immunologisch relevante Gensignaturen gefunden werden, die gravierende Prozesse beschreiben, wie z.B. die Graft versus Host oder die akute Nierentransplantat Abstossungsreaktion. Des Weiteren konnten Gensignaturen in Stadium IB2 gefunden werden, welche auf MT1-MMP abhängige Migration und Invasivität hinweisen. Diese Gensignaturen sind in Begleitung einer Gen Expressionssignatur, die ECM Rezeptor vermittelte Interaktionen bedeuten. Schlussfolgernd bedeutet die Analyse von Zervixkarzinom Gen Expressionsprofilen eine neue Perspektive auf HPV vermittelte Transkriptionsprozesse. Diese neue Aussicht birgt ein tiefgehendes Verständnis der karzinogenen Konsequenzen und kann sogar eine Verbesserung der therapeutischen Möglichkeiten bieten. <br /><em>Tumor Subtypisierungsstudie </em>Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war eine großangelegte Subtypisierungsanalyse von Microarray Genexpressionsdaten aus vier öffentlich verfügbaren Brustkrebs Studien (n=514) [7]. Zu diesem Zweck wurden sogenannte „Voting“-Methoden aus der Literatur [8–10] berücksichtigt und ein neuer Algorithmus entwickelt, welcher die Extraktion von Genen, deren Bewertung und letztlich die Wahl eines Klassifiziers zur Aufgabe hat. Der Algorithmus basiert auf maschinellen Lernverfahren und statistischen Klassifikationsalgorithmen, die dem Bioconductorpaket CMA entnommen wurden [11]. Das sogenannte „multi-class“ Problem wurde über Consensus- Clustering [12, 13] gelöst. Diese Methode zeigte beachtlichen Erfolg in Wilkerson et al. [14]. Die erhaltenen Gensignaturen wurden mit Hilfe der „Gene Set Enrichment Analysis“ (GSEA) auf ihren biologischen Wert untersucht [6], die klinischen Eigenschaften der Signaturen konnten mit „gene expression-based outcome for breast cancer online„ (GOBO) analysiert werden. Durch die Klassifizierung der molekularen Subtypen konnten spezifische Gensignaturen erhalten werden, die biologische und klinische Relevanz aufweisen. Die Subtyp spezifischen Signaturen sind hoch prädiktiv für DMFS von Tamoxifen behandelten Brustkrebspatienten. Zudem konnte über Consensus-Clustering und der vorgestellten Klassifizierungsmethode eine Charakterisierung von triple negativen Subtypen erzielt werden, in der drei potentielle Fälle nachgewiesen wurden. Ein potentieller Subtyp wies eine geringe E2F4 Expression auf und die charakterisierende Signatur war prädiktiv für RFS von Östrogen negativen Brustkrebspatienten. Die Gen Expressionssignaturen der übrigen Subtypen haben Ähnlichkeiten mit luminal B Tumoren. Die Klassifikation der Expressionsprofile von Brustkrebspatienten enthüllt potentielle, neue Tumorsubtypen, die klinische Auswirkungen beinhalten. Des Weiteren bietet ein Verstehen der komplexen und abberanten Biologie von Brustkrebs zusätzliches Potential für neue Strategien in der klinischen Therapie.