Sulfokonjugierte Sympathomimetika in der Dopinganalytik

Abstract

Stimulanzien und β₂-Sympathomimetika sind aufgrund ihrer leistungssteigernden Eigenschaften von der <i>World-Anti-Doping-Agency</i> (WADA) zur Anwendung im Sport verboten. Verschiedene Sympathomimetika (α- und β₂-Agonisten) werden als Konjugate ausgeschieden und bisher nach chemischer Hydrolyse der Phase-II-Metaboliten bei Dopingkontrollen mittels LC-MS/MS oder GC-MS analysiert. Analytische Verfahren in der Dopinganalytik befinden sich in einer ständigen Entwicklung, um die steigende Anzahl von verbotenen Substanzen und hohe Probenzahlen mittels zeit- und kostensparender Analyseverfahren kompensieren zu können. Eine Möglichkeit bietet die Direktinjektion von Urinproben ohne vorangehende, zeitaufwendige Probenvorbereitung einschließlich Konjugatspaltung. Zum Nachweis von verbotenen Substanzen mittels Direktmessung aus Urin sind detaillierte Kenntnisse zum Metabolismus der jeweiligen Substanzen notwendig, um geeignete Zielanalyten auszuwählen. Zur Entwicklung geeigneter analytischer Methoden und Charakterisierung der intakten Konjugate ist Referenzmaterial erforderlich, das im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich synthetisiert wurde. So konnte ausreichend Referenzsubstanz der Sulfokonjugate von Etilefrin, Octopamin, Terbutalin, Fenoterol und Salbutamol erhalten werden, um es mittels LC (ESI)-MS/MS, HRMS und NMR zu charakterisieren. Zur Gewinnung der Referenzsubstanzen wurde die unselektive chemische Synthese, die Synthese unter Zuhilfenahme von Schutzgruppen,die <i>in vitro</i> Synthese und das Isolieren der Zielanalyten aus Ausscheidungsurinproben untersucht und miteinander verglichen. Mit Hilfe der erhaltenen Referenzmaterialien der Sulfokonjugate von Octopamin, Terbutalin, Fenoterol und Salbutamol war es möglich, Ausscheidungsurinproben der jeweiligen Aglyka zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl Octopamin, Terbutalin, Fenoterol und Salbutamol überwiegend sulfokonjugiert ausgeschieden werden und eine Exkretion der Sulfokonjugate die an der phenolischen Position verestert sind, typisch ist. Für das β₂-Sympathomimetikum Fenoterol konnten drei verschiedene Sulfokonjugate <i>in vitro</i> synthetisiert und erstmalig auch<i>in vivo</i> nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde mit Hilfe von bereits vorhandenem Referenzmaterial der Sulfokonjugate von <i>p</i> Hydroxyamphetamin, <i>p</i> Hydroxymethamphetamin und Etamivan eine Methode entwickelt, um diese Substanzen im Dopingkontrollurinproben nachzuweisen. Das Verfahren stellte sich aufgrund seiner guten Präzision, hoher Spezifität, niedriger Nachweisgrenzen und Robustheit als sehr valide heraus. Dabei zeichnet sich die Methode durch ein Minimum an Probenvorbereitung aus, womit sie besonders kostengünstig und schnell wird und einen erhöhten Probendurchsatz im Labor ermöglicht. Im Zuge der Vereinfachung von Analysemethoden in der Dopinganalytik mit dem Ziel viele verschiedenen Substanzklassen in einer Prozedur zu erfassen, ermöglicht die entwickelte Direktinjektionsmethode mittels LC-MS/MS eine kombinierte Analytik mit Substanzen, die überwiegend unverändert ausgeschieden werden (z. B. Diuretika, Narkotika, bestimmte Stimulanzien und β₂-Agonisten).