Frei zirkulierende DNA als diagnostischer Marker beim Harnblasenkarzinom

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden frei zirkulierende DNA-Fragmente mit ihrer Fragmentgröße und ihrem Methylierungsmuster im Serum von Patienten mit Blasen-karzinom bestimmt, um ihre Eigenschaft als potentieller Biomarker in der Diagnostik, Prognose und Therapie Monitoring des Blasenkarzinoms zu analysieren. Diesbezüglich wurde die zellfreie DNA aus Serumproben von insgesamt 227 Patienten gesammelt. Von diesen Patienten unterzogen sich 132 einer transurethralen Resektion der Blase mit Nachweis eines histologisch gesicherten Blasenkarzinoms in 84 Fällen, weitere 11 Patienten unterzogen sich einer radikalen Zystektomie. Des Weiteren gehören zu dem Patientenkollektiv 31 Patienten mit einer benignen urologischen Erkrankung in Form von benigner Prostatahyperplasie und Harnblaseninkontinenz, wobei ein Blasenkarzinom zystoskopisch ausgeschlossen wurde sowie den 53 gesunden Probanden als Kontroll-gruppe.<br /> Vorherige Studien zeigten, dass durch Fragmentierungsmuster eine Differenzierung von Karzinompatienten und Gesunden möglich ist und außerdem einen Rückschluss bezüglich ihrer Genese zulassen (Apoptose <200bp und Nekrose >200bp). Diesbezüglich konnte in der vorliegenden Studie mittels quantitativer RT-PCR die Menge an frei zirkulierender kleiner (ACTB-106, 106 bp) und großer (ACTB-384, 384 bp) DNA-Fragmente ermittelt werden. Aus dem Verhältnis von großen und kleinen DNA-Fragmenten wurde die Integrität der freien DNA berechnet. Es zeigte sich, dass ACTB-106 bei Patienten mit Blasenkarzinom verglichen mit den Patienten ohne Blasenkarzinom signifikant erhöht ist (p>0,001), während ACTB-384 in den Untersuchungen keine Signifikanz aufweist (p=0,081). Aus den Berechnungen bezüglich der DNA-Integrität geht hervor, dass die freie DNA der Tumorpatienten eine signifikant geminderte Integrität aufweist im Vergleich mit den Patienten ohne Blasenkarzinom (p<0,001), was somit auf einen apoptotischen Ursprung der DNA schließen lässt.<br /> Um die diagnostische Information festzulegen zeigte sich in den ROC-Analysen, dass ACTB-106 (AUC 0,686, Sensitivität 91,6 %, Spezifität 43,3 %) und die DNA-Integrität (AUC 0,719, Sensitivität 59,8 %, Spezifität 75,8 %) eine Abgrenzung von Blasen-karzinompatienten und Patienten ohne Karzinom (inklusive Patienten mit benignen Erkrankungen und gesunde Kontrollen) erlauben und somit die genaueste diagnostische Information bieten.<br /> Des Weiteren wurde mittels methylierungssensitiver PCR die zellfreie DNA auf Hypermethylierungen in den Promotorbereichen von neun ausgewählten Genen analysiert. Die häufigsten Methylierungen im Kollektiv der Tumorpatienten finden sich in den Promotoren von TIMP3 (NMIBC:88 %, MIBC 75 %), RAR-β (NMIBC: 61,4 %, MIBC: 45 %) und APC (NMIBC: 52 %, MIBC: 65 %). Hierbei resultiert jedoch, dass nur die Genorte APC (Spezifität: 65,2 %, Sensitivität: 54,7 %, AUC: 0,58) und RASSF1A (Spezifität: 87,1 %, Sensitivität: 28,4 %, AUC 0,57) einen signifikanten Unterschied zwischen Patienten mit Blasenkarzinom und den Patienten ohne Blasenkarzinom bieten. Interessanterweise ergibt sich aus der Summe aller Genorte (m-Score) eine hohe diagnostische Signifikanz (p<0,001) und erreicht eine Spezifität von 73 % mit einer mittleren Sensitivität von 46,3 %. Die AUC hat in der Summe aller Genorte auch ihre größte Fläche mit 0,64 und somit die höchste Testgenauigkeit.<br /> Obwohl in dieser Studie ein signifikanter Anstieg von kleinfragmentärer zellfreier DNA sowie eine Erniedrigung der DNA-Integrität von Blasenkarzinompatienten verglichen zu der gesamten Gruppe von Patienten ohne Karzinom demonstriert werden konnte, ist der Enthusiasmus bezüglich zellfreier DNA als potentieller Biomarker in der Diagnostik des Blasenkarzinoms gedämpft, wenn man die Subgruppen der Nicht-Karzinom-Patienten-Kohorte genauer analysiert. Patienten mit einem Blasenkarzinom in der Anamnese, jedoch ohne aktuellen Tumornachweis in der TURB weisen die gleiche Menge an zellfreier DNA und ein gleiches Fragmentierungsmuster auf wie die Karzinompatienten. Während Patienten mit benignen urologischen Erkrankungen und die gesunden Kontrollen am ehesten ursächlich für den Anstieg der kleinfragmentären zellfreien DNA von Karzinompatienten zu betrachten sind, wenn man den Vergleich zu der gesamten Nicht-Karzinom-Kohorte zieht. Die treffsichere Vorhersagefähigkeit der zellfreien DNA mit ihrem Fragmentierungsmuster als Biomarker im Serum von Patienten, die sich einer TURB unterzogen zum Nachweis eines bestehenden Blasenkarzinoms ist limitiert und scheint diesbezüglich keine relevante zusätzliche diagnostische Information zu erbringen.