Functional roles of the chemokine CCL17 in skin and brain immunity

Abstract

The chemokines CCL17 and CCL22 represent ligands of CCR4 and are mainly produced by dendritic cells (DCs) and macrophages (Mφs) in the immune system. CCL17 was found to promote various inflammatory and allergic diseases, whereas CCL22 has more often been associated with an immunosuppressive environment. These differential functions are reflected by preferential recruitment of distinct subsets of immune cells to sites of inflammation. Whereas CCL17 induces chemotaxis of effector T cells and facilitates T cell-DC interactions, CCL22 appears to be involved in the recruitment of regulatory T cells. In addition, CCL22 induces a more rapid desensitization and internalization of CCR4 than CCL17, implying biased agonism of CCL17 and CCL22. <br /> In this thesis, newly generated CCL17/22-double-deficient (CCL17^E/E/22^-/-) mice were used to further explore the differential function of CCL17 and CCL22. In agreement with previous reports in the literature, CCR4-deficient mice displayed an exaggerated contact hypersensitivity (CHS) response. In contrast, CCL17^E/E/22-/- and CCL17-single deficient (CCL17^E/E) mice were protected from CHS. Thus, the opposing phenotypes of CCR4KO- versus CCL17^E/E mice cannot be explained by residual CCL22 signaling in CCL17^E/E mice. Furthermore, intravital microscopy (IVM) and flow cytometry were performed to characterize CCL17⁺ cells in the skin of CCL17-EGFP reporter (CCL17^E/+) mice in a wild-type (WT) and GM-CSF-deficient background. Whereas expression of CCL17 in skin DCs was GM-CSF-dependent, transcription of CCL17 in skin Mφs occurred independently of GM-CSF. In line, two distinct CCL17⁺ cell types could be identified in the skin by IVM as judged by their motility: a population of sessile CCL17⁺ cells in close proximity to dermal blood vessels, presumably representing perivascular Mφs, and a migratory cell population resembling DCs in the interstitium. <br /> To develop novel strategies for treatment of contact allergy, two RNA aptamers were validated <em>in vitro </em>and<em> in vivo</em> for their capability to neutralize CCL17. The two aptamers effectively inhibited the directed migration of the CCR4⁺ lymphoma line BW5147.3 towards CCL17 in a dose-dependent manner. In the CHS model, systemic application of either one of the aptamers significantly prevented the ear swelling response and reduced T cell infiltration into the ears. These experiments provide proof-of-principle that CCL17-specific aptamers may potentially be used therapeutically in humans to treat allergies and perhaps other inflammatory diseases. <br /> In the second part of the thesis, the expression and function of CCL17 in the murine brain was investigated. CCL17/EGFP⁺ neurons were primarily detected in in a subset of hippocampal CA1 neurons, whereas only few cortical neurons stained positive for CCL17/EGFP. The basal Ccl17 expression in hippocampal neurons strongly increased by peripheral challenge with lipopolysaccharide (LPS) in a tumor necrosis factor (TNF) dependent manner. In addition, Ccl22 was also detected in the hippocampus, but its LPS-dependent upregulation required GM-CSF. Analysis of brains from CCL17^E/E mice revealed a diminished microglia density in the hippocampus under homeostatic and inflammatory conditions. A combination of confocal microscopy and computer-assisted morphological analyses demonstrated that microglia from naïve CCL17^E/E mice displayed a reduced cellular volume and a more polarized process tree compared to WT controls. Furthermore, overall branching, cell surface area and total tree length of microglia from naïve CCL17^E/E mice were similar to that of microglia from LPS-treated WT mice. In addition, electrophysiological recordings of acute slices from naïve WT and CCL17^E/E mice indicated a downmodulation of basal synaptic transmission at CA3-CA1 Schaffer collaterals through CCL17. In conclusion, the work presented in this thesis identifies CCL17 as a homeostatic and inducible neuromodulatory chemokine which affects the abundance and morphologic appearance of microglia as well as synaptic transmission in the hippocampus.

<strong>Funktionen des Chemokins CCL17 im Immunsystem der Haut und des Gehirns</strong><br /> Die Chemokine CCL17 und CCL22 sind Liganden von CCR4 und werden hauptsächlich von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen produziert. Für CCL17 wurde gezeigt, dass es verschiedene entzündliche und allergische Erkrankungen fördert. Im Gegensatz dazu, wird CCL22 eher mit einer immunsuppressiven Wirkung assoziiert. Diese gegenläufigen Funktionen spiegeln sich ganz besonders in der Fähigkeit wider, nur bestimmte Immunzellen zu Entzündungsherden zu rekrutieren. Während CCL17 die Chemotaxis von Effektor-T-Zellen induziert und eine Interaktion von T-Zellen und DCs erleichtert, wird CCL22 hauptsächlich mit der Rekrutierung regulatorischer T-Zellen, z.B. in das Tumormikromilieu, in Verbindung gebracht. Im Vergleich zu CCL17 führt CCL22 außerdem zu einer schnelleren Desensibilisierung und Internalisierung von CCR4, was eine gewisse funktionelle Selektivität (engl. biased agonism) von CCL17 und CCL22 für CCR4 impliziert. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurden neu generierte CCL17/22-doppelt defiziente Mäuse (CCL17^E/E/22^-/-) dazu verwendet, die differentielle Funktion von CCL17 und CCL22 weitergehend zu untersuchen. Interessanterweise entwickelten CCL17^E/E/22^-/- Mäuse genau wie CCL17-defiziente (CCL17^E/E) Mäuse eine deutlich reduzierte Kontakthypersensitivitäts-(CHS)-Reaktion im Vergleich zu wildtypischen (WT) Kontrollmäusen, während CCR4^-/- Mäuse eine verstärkte allergische Reaktion ausbildeten. Somit konnte gezeigt werden, dass der schon bekannte Unterschied zwischen CCR4^-/- und CCL17^E/E-Mäusen im CHS Modell nicht durch die in CCL17^E/E Mäusen verbleibende Wirkung von CCL22 erklärt werden kann. Darüber hinaus wurden intravitale Mikroskopie (IVM) und Durchflusszytometrie angewandt, um CCL17-positive Zellen in der Haut von CCL17-EGFP Reporter (CCL17^E/+) Mäusen in der An- bzw. Abwesenheit von GM-CSF zu charakterisieren. Hier konnte eine GM-CSF-abhängige Expression von CCL17 in DCs der Haut gezeigt werden, wohingegen die Regulation von CCL17 in Makrophagen unabhängig von GM-CSF war. Ferner konnten mittels IVM zwei verschiedene CCL17-positive Zelltypen in der Haut nachgewiesen werden. Neben einer sessilen CCL17-positiven Zellpopulation, welche in der Nähe von dermalen Blutgefäßen lokalisiert war und möglicherweise zu den perivaskulären Makrophagen gehört, wurde eine zweite, durch das Interstitium wandernde CCL17-positive Zellpopulation beobachtet , bei der es sich wahrscheinlich um DCs handelt. <br /> Um neue Möglichkeiten zur Behandlung von Allergien zu entwickeln, wurden zwei neuartige RNA-Aptamere auf ihre Fähigkeit hin getestet, CCL17 <em>in vitro </em>und <em>in vivo </em>zu neutralisieren. Mithilfe eines Zell-Migrationstests konnte gezeigt werden, dass beide Aptamere die gerichtete Migration der CCR4⁺-Lymphom-Zelllinie BW5147.3 entlang eines CCL17-Gradienten dosisabhängig hemmen. Außerdem konnte in Aptamer-behandelten WT Mäusen eine deutlich reduzierte T-Zell-Infiltration und eine verringerte Ohrschwellung gemessen werden. Des Weiteren konnte in Inhibitionsexperimenten gezeigt werden, dass CCL17 eine vielversprechende Zielstruktur zur Behandlung von allergischen und möglicherweise auch anderen entzündlichen Krankheiten darstellt. <br /> Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression und Funktion von CCL17 im murinen Gehirn untersucht. CCL17-exprimierende Neuronen konnten vor allem in der hippocampalen CA1 Region identifiziert werden, während im Kortex nur wenige CCL17-produzierende Neuronen nachgewiesen wurden. Systemische Gabe von Lipopolysaccharid (LPS) führte zu einer stark erhöhten Expression von <em>Ccl17</em> und <em>Ccl22</em> im Hippocampus. Interessanterweise war die LPS-induzierte Expression von <em>Ccl17</em> abhängig von lokal produziertem Tumornekrosefaktor (TNF), während GM-CSF die Expression von <em>Ccl22</em> regulierte. Eine genaue Untersuchung der Gehirne von LPS-behandelten CCL17^E/E- und WT-Mäusen und entsprechenden Kontrolltieren ergab eine stark reduzierte Anzahl von Mikroglia in Hippocampi von CCL17^E/E Mäusen. Des Weiteren konnte mittels konfokaler Mikroskopie und einer computergestützten morphologischen Analyse gezeigt werden, dass Mikroglia in naiven CCL17^E/E Mäusen, im Vergleich zu WT Mäusen, ein deutlich reduziertes Zellvolumen und einen stärker polarisierten Prozessbaum aufweisen. Außerdem ähnelten die Gesamtverzweigung (engl. ramification), die Zelloberfläche und die Gesamtbaumlänge der Mikroglia von naiven CCL17^E/E-Mäusen denen der Mikroglia von LPS-behandelten WT-Mäusen. Des Weiteren wiesen elektrophysiologische Messungen an akuten Gehirnschnitten aus naiven WT- und CCL17^E/E-Mäusen darauf hin, dass CCL17 die basale synaptische Übertragung zwischen den Schaffer-Kollateralen der CA3-CA1 Region reprimiert. Damit konnte CCL17 erstmalig als ein neues, homöostatisches und induzierbares neuromodulatorisches Chemokin identifiziert werden, welches sowohl die Häufigkeit und Morphologie von Mikroglia als auch die synaptische Übertragung im Hippocampus beeinflusst.