Characterization of the alfalfa mosaic virus as expression, presentation, delivery and screening system for potential epitopes derived from the respiratory syncytial virus fusion protein

Munz, Georg; Fischer, Rainer

doi:urn:nbn:de:hbz:82-20050235

Characterization of the alfalfa mosaic virus as expression, presentation, delivery and screening system for potential epitopes derived from the respiratory syncytial virus fusion protein

Munz, Georg (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Georg Alexander Munz

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

Umfang112 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Univ., Diss., 2005

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-02-14

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-20050235
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62074/files/Munz_Georg.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
RS-Virus (Genormte SW) ; Epitop (Genormte SW) ; Peptidbibliothek (Genormte SW) ; Virusimpfstoff (Genormte SW) ; Alfalfa-Mosaik-Virus (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; AlMV (frei) ; RSV (frei) ; Fusion Protein (frei) ; epitope vaccine (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Pflanzenviren werden seit einiger Zeit erfolgreich für die Produktion und Präsentation von immunogenen Peptiden eingesetzt, und ihre Verwendung als Impfstoff wird zunehmend wahrscheinlicher. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob das Alfalfa Mosaic Virus (AlMV) zur Präsentation (i) einer Peptidbibliothek des Fusion Protein (F), des Respiratoischen Syncytial Virus (RSV), (ii) von Epitopemimics und (iii) antiviralen Peptiden geeignet ist. Die RSV-F Peptidbibliothek wurde dann zur Identifizierung von B- und T-Helfer Zell Epitopen eingesetzt. Anhand der Expressionseigenschaften der oben aufgeführten AlMV-RSV-F-Konstrukte konnten folgende Faktoren als wichtig für die N-terminale Peptid Expression auf dem AlMV Hüllprotein identifiziert werden: (i) Ladung, (ii) Hydrophobizität und (iii) Peptidgrösse. Postive geladene Peptide und daraus hervorgehende rekombinante Hüllproteine lösten eine Hypersenitivitätsreaktion aus; vermutlich durch verschlechterte Partikelformation. Diese Konstrukte konnten durch die Kompensation mit sauren Aminosäuren optimiert werden. Hohe Hydrophobizität veringerte ebenfalls die Expressionseffizienz; vermutlich durch eine Integration der Partikel in die Zellmembranen und dadurch erschwerte Aufreinigung. Die Kompensation mit hydrophilen Aminosäuren verbessert die Expressionseigenschaften. Unter optimaler Aminosäurezusammensetzung konnten Peptide bis zu einer Länge von 50aa exprimiert werden. Generell aber waren kleine Peptide besser darstellbar. Epitopemimics, die durch ein Phage Display gegen den neutralisierenden Antikörper Hnk20 gewonnen wurden und gute Bindungseigenschaften als auch Kompetition zeigten, verloren diese nach Subklonierung auf das AlMV Hüllprotein. Mäuse, die mit den rekombinaten AlMV-RSV-F Partikeln immunisiert wurden, generierten eine RSV-F spezifische Immunantwort. Rekombinante AlMV-RSV-F Partikel wurden auch erfolgreich zur Identifizierung von T-Helferzell Epitopen eingesetzt. Aus einer Gruppe von 22 Peptiden ergaben mindestens 6 eine RSV-F spezifische IFN-gamma Immunantwort. Das Konstrukt AlMV-RSV-F-24 induzierte sogar in allen getesteten HLA-DR typen eine Postitivantwort und könnte ein universelles T-Helfer-Epitope darstellen. Eine T-Helfer-Zell Antwort des Typs II konnte nicht festgestellt werden. Ein Vergleich der in vitro Daten mit in silico generierten ergab, dass keines der verwendeten Programme in der Lage war die Epitope korrekt vorherzusagen; allerdings leisteten sie einen Beitrag zur Bestimmung der Epitopekonsensussequenz.

Plant viruses have gained sustainable interest as presentation and production systems for immunogenic peptides within the last decade and consequently their use as vaccines has become an increasingly viable proposition. In this study it was investigated if Alfalfa mosaic virus could be used to present (i) an RSV-F-derived peptide library, (ii) phage-selected mimics and (iii) anti-viral peptide fusion inhibitors. The library was then used to screen for B- and T-cell epitopes. The data obtained was used to establish AlMV as a screening tool and evaluate its performance in different applications. This is the first study in which a plant virus has been used to identify potential B and T-helper cell epitopes for vaccine development. Based on the performance of different AlMV-RSV-F constructs three factors were identified that influenced recombinant peptide expression as N-terminal AlMV CP fusion: (i) charge, (ii) hydrophobicity and (iii) size. Positively charged peptides and resulting chimeric CPs that had a charge and pI significant higher than wt, were found to be difficult or unexpressible. This was probably due to insufficient particle formation and a resulting induction of a plant HR. The performance of these constructs was improved by the addition of acidic amino acids that compensated the positive charge. High level of hydrophobicity decreased chimeric particle production as well. Peptides that contained more hydrophobic then polar aas were difficult to purify. This could be explained by the affinity of the hydrophobic peptides for the cell membrane and consequently their loss in the membrane fraction during sample preparation or virus purification. Compensating the hydrophobic amino acids with polar amino acids did improve the performance. Two phage-displayed random peptide libraries were successful screened for HNK20 binders. Several different phages showed good binding properties to HNK20 antibodies and two of them competed with RSV for binding. However, these properties were lost after expression of the mimics on AlMV particles. AlMV CP has already been used to successful express, present and deliver known B-cell epitopes from various pathogens including rabies virus, HIV and RSV. Furthermore, we have shown that all RSV-F derived constructs tested in mice generated a specific RSV IgG response out of which six covered known neutralization sites and are therefore likely to generate neutralizing abs. Chimeric AlMV particles were also successfully used as presentation, delivery and screening tool for T-helper cell epitopes using human dendritic cells for the assay. Out of a pool of 22 constructs at least 6 gave an RSV-F specific IFN-g response in one or more different donors. AlMV-RSV-F-24 (aa 390-413) gave a potential universal TH1 response when tested in 5 different donors, that covered the most common HLA-DR-types in the Caucasian population. Several other peptides also gave an IFN-gamma response. Our findings correlate well with those described in literature, thus indicating that the AlMV-CP presented RSV-F- derived peptides are processed correctly. No TH2 response could be detected, although it is possible that peptides presented on AlMV surface could have a TH1 bias. A comparison of the in vitro data with those generated in silico revealed that none of the programs used was able to predict T-helper cells correctly. However, consensus sequences of potential epitopes within the 24mer could be identified.

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