Molekulargenetische Effekte nach Inhibitorbehandlungen sowie Charakterisierung gonadenspezifisch exprimierter Gene von Schistosoma mansoni

Abstract

Der human- und tierpathogene Trematode Schistosoma mansoni besitzt eine nahezu einzigartige Reproduktionsbiologie, bei der es erst durch einen permanenten Paarungskontakt mit dem Männchen zur sexuellen Reifung des Weibchens kommt, eine Voraussetzung für die Eiproduktion und die Aufrechterhaltung des Lebenszyklus. Grundlagen dieses Prozesses sind die Steigerung mitotischer Aktivität sowie die Initialisierung verschiedener Signaltransduktionskaskaden in den weiblichen Reproduktionsorganen, die Differenzierungsprozesse steuern. Einige hoch konservierte Moleküle dieser Signalwege konnten bereits identifiziert und charakterisiert werden, darunter der Typ I-Rezeptor der TGFbeta-Familie (SmTbetaRI) und zelluläre Src-Tyrosinkinasen wie SmTK3. Erste funktionelle Studien in vitro mit spezifischen Inhibitoren für Typ I TGFbeta-Rezeptoren (TRIKI) und Src-Kinasen (Herb A) zeigten einen Einfluss dieser Moleküle auf die mitotische Aktivität der Weibchen und die Oviposition. Ferner führte die Kombination beider Inhibitoren zu additiven Effekten dieser physiologischen Veränderungen, weshalb eine Kooperation beider Signalwege postuliert wurde. Eine Inhibierung der SmTK3 durch Herb A wurde bereits beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand eines Kinase-Assays gezeigt werden, dass TRIKI SmTbetaRI im heterologen Xenopus-Oocyten-System inhibiert. Ferner wurden vergleichende Transkriptomstudien zur Identifizierung von differentiell regulierten Genen nach in vitro Behandlung adulter Schistosomenweibchen mit TRIKI bzw. Herb A (einzeln oder in Kombination) mit Hilfe von Microarrays durchgeführt. Dies führte zur Identifizierung einer Vielzahl an Genen, die unter gemeinsamer transkriptioneller Kontrolle der SmTbetaRI- sowie Src-Kinasen-vermittelten Signalwege stehen. Diese Gene kodieren u.a. Signalmoleküle, Ca2+-assoziierte Proteine, Hsp- und Oberflächenproteine sowie darmassoziierte Moleküle. Die Transkriptionsänderungen wurden exemplarisch durch qPCR-Analysen bestätigt, wodurch ein weiterer und erster molekularer Hinweis für die Kooperation beider Signalwege erbracht wurde. Darüber hinaus deuteten die Daten auf einen stärkeren Einfluss des Src-Kinasensignalwegs auf die Regulation der Transkription.Aufgrund der beschriebenen reduzierten Oviposition durch diese Inhibitoren in vitro lag ein Fokus weiterer Analysen auf der Untersuchung differentiell regulierter Gene, deren kodierte Proteine Funktionen bei der Eischalsynthese besitzen. Bei repräsentativ ausgewählten Genen wie den Eischalvorläufergenen p14 und p48 sowie dem SmTYR1-Gen, das für das schistosomale Eischalprotein-Vernetzungsenzym Tyrosinase 1 kodiert, konnte die modulierende Regulation der Transkription durch die kooperativ agierenden SmTbetaRI- und Src-Kinase-Signalwege bestätigt werden. Dabei korrelierte die reduzierte Transkription mit der ebenfalls reduzierten Eiproduktion nach Herb A-, bzw. Kombinationsbehandlung. Daneben offenbarten mikroskopische Untersuchungen der Morphologie inhibitor-behandelter adulter Würmer zum ersten Mal auch eine stark veränderte Gastrodermis nach Langzeitbehandlung (5-6 Tage) mit Herb A oder TRIKI/HerbA. Dieser Befund erklärt das Sterben der Würmer nach dieser Expositionsdauer.Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden weiterführende funktionelle Studien für identifizierte Interaktionspartner der gonadenspezifisch exprimierten Kinasen SmTK3 und SmTK6 durchgeführt. Dabei konnte SmEps8 als häufigster und stärkster upstream-Interaktionspartner der SmTK3 charakterisiert werden. Bei SmEps8 handelt es sich um ein potentielles EGFR-Substrat, dessen Interaktion mit EGFR-Molekülen aus S. mansoni (SER) untersucht wurde. Mit Hilfe von Y2H-Experimenten konnte eine schwache Bindung zwischen SmEps8 und den intrazellulären Bereichen von SER und SER2 detektiert werden. Mit Hilfe von in situ-Hybridisierungen wurde eine Kolokalisation der Transkripte von SmTK3, SmEps8 und SER in Ovar und Vitellarium festgestellt, womit diese Ergebnisse auf eine putative SER-SmEps8-SmTK3-Signalkaskade in den Reproduktionsorganen des Weibchens hindeuten. In einer vorhergehenden Studie wurde bereits SmDLG als ein upstream-Interaktionspartner der Src-/Abl-Hybridkinase SmTK6 identifiziert. In Drosophila melanogaster bildet SmDLG einen Komplex mit den Proteinen Scrib und LGL, der u.a. Zellpolarität kontrolliert. Durch Datenbankanalysen konnten ähnliche Proteine dieser potentiellen Bindungspartner in S. mansoni identifiziert und im Weiteren kloniert werden (SmScrib und SmLGL). Anschließende Y2H-Versuche führten zu ersten Hinweisen für direkte Interaktionen dieser drei Moleküle. Schließlich wurden die Transkripte dieser Gene über in situ-Hybridisierungen hauptsächlich im Ovar detektiert. Diese Resultate deuten die Möglichkeit molekularer Interaktionen von SmTK6, SmDLG, SmScrib, und SmLGL an und geben einen ersten Hinweis auf eine Signalkaskade, die Zellpolarität in den Oocyten über eine Src-/Abl-Hybridkinase steuern könnte. Schistosoma mansoni is a parasite and pathogenic for humans and animals. As members of the trematodes schistosomes show a nearly unique biology of reproduction, in which only a permanent pairing contact with the male leads to the sexual maturation of the female, a prerequisite for egg production and maintenance of the life cycle. The molecular basis of this process is the induction of mitotic activity and the initiation of different signal transduction cascades within the female reproductive organs. Some highly conserved members of these pathways were identified and characterised such as the type I receptor of the TGFbeta family (SmTbetaRI) and cellular tyrosine kinases like SmTK3. According to first functional in vitro studies with specific inhibitors of type I TGFbeta-receptors (TRIKI) and Src kinases (Herbimycin A) an influence on mitotic activity and oviposition by both molecules was shown. By combining both inhibitors an additive effect of these physiological changes was observed, leading to the hypothesis of cooperating signalling pathways. The inhibition of SmTK3 by Herb A was shown previously.In this thesis the inhibition of the schistosome TbetaRI by TRIKI was demonstrated by a kinase assay using the heterologous Xenopus oocytes system. Furthermore, comparative transcriptome analyses were performed to identify differentially regulated genes following in vitro treatment of adult female schistosome with TRIKI and Herb A (separately or in combination) using microarrays. A huge number of genes were identified as transcriptionally controlled by SmTbetaRI- as well as Src kinases-mediated signalling cascades. Amongst others, genes coding for signalling molecules, Ca2+-associated proteins, Hsps, surface proteins, and gut-associated molecules were detected. The transcriptional changes were validated exemplarily for selected genes, supporting the hypothesis of the cooperation of both pathways for the first time also at a molecular basis. Furthermore, the obtained data indicated a stronger influence of the Src kinase pathway for gene regulation.Since the in vitro treatment with both inhibitors led to a reduced oviposition, one of the main objectives of the transcriptome analyses was the identification of genes, whose encoded proteins are involved in eggshell-formation. As representative candidates genes coding for the eggshell precursor proteins p14 and p48, as well as the SmTYR1 gene, which encodes the schistosomale tyrosinase 1, which is necessary for cross-linking eggshell proteins, were selected. The obtained results confirmed the modulating character of the cooperating SmTbetaRI and Src-kinase pathways on the transcriptional regulation of these genes. These results correlated with the decreased egg production following the Herb A and combined treatment. Unexpectedly, the microscopical investigation of the morphology of treated adult worms revealed for the first time an additional deleterious effect on the gastrodermis following long-time (5-6 days) treatment with Herb A or the combined inhibitors. This result explained death of these worms following this treatment period.The second part of this thesis included functional studies of identified interaction partners of the gonad-expressed genes SmTK3 and SmTK6. SmEps8 was characterised as the most abundant and strongest upstream interaction-partner of SmTK3. Since SmEps8 is a potential substrate of EGFRs, the interaction of SmEps8 with EGFR homologues of S. mansoni (SERs) was investigated. Weak interactions of SmEps8 and the intracellular regions of SER and SER2 were detected by Y2H assays. According to in situ hybridisations SmTK3, SmEps8 and SER co-localised within the ovary and vitellarium, indicating a putative SER-SmEps8-SmTK3 signalling cascade within the reproductive organs of the female. In a previous study SmDLG was identified as an upstream interaction-partner of the Src/Abl hybrid-kinase SmTK6. In Drosophila melanogaster DLG interacts with Scrib and LGL in a complex, which controls cell polarity. Within the S. mansoni genome database homologous proteins were identified and subsequently cloned (SmScrib and SmLGL). First Y2H assays revealed direct interactions of these three molecules. Finally, in situ hybridisations localised the transcripts of these genes within the ovary. These findings point to the possibility of molecular interactions of SmTK6, SmDLG, SmScrib, and SmLGL, which is a first hint of a signalling cascade that may control cell polarity in oocytes via a Src/Abl hybrid-kinase.