Wnt signaling in right ventricular remodeling

Abstract

Right ventricular remodeling refers to changes in size, shape and function of the right heart after cardiac injury. It is a progressive disorder connected to several conditions, including pulmonary hypertension. It is also a leading predictor for the development of right heart failure and death. Nonetheless, until recently the importance of right ventricular function in health and disease has been often underestimated. Previous studies showed that Wnt signaling pathway plays an important role in left ventricular remodeling in response to hypertrophic stimuli. While all of the available literature describes the impact of this signaling cascade in maladaptive growth of the left ventricle, its role in the right heart hypertrophy is unknown. Given that, we hypothesized that canonical Wnt signaling could also play a role in the development of right heart hypertrophy. As the Wnt pathway is crucial for the development of right ventricle we speculated its contribution to RVH could be more prominent.In this study, we employed and characterized the PAB and MCT animal models of right ventricular hypertrophy. Both models presented with substantial right heart hypertrophy as judged by RV/LV+S ratios as well as mRNA expression of known hypertrophic markers. Additionally, the right ventricles of PAB and MCT animals showed advanced fibrotic changes.We were able to show an upregulation of several Wnt signaling molecules, including beta-catenin, GSK3ß and Frizzled receptors on mRNA level in hypertrophied right ventricles of PAB animals. Most importantly, beta-catenin and GSK3beta protein levels were also elevated in those animals. Similarly, we found increased mRNA levels of GSK3beta and Fz2 receptor in the right ventricles of MCT rats. beta-catenin and GSK3beta protein levels showed a tendency to be elevated in those animals but did not reach significance level. Furthermore we found a significant upregulation in beta-catenin expression in cardiac fibroblasts derived from right ventricles of PAB animals as compared to Sham-RVs implying that CFs could be at least in part responsible for observed changes. Based on BrdU incorporation experiments, we alsofound that right ventricular fibroblasts exhibit increased proliferation rates. To further elucidate if this increased proliferation could be dependent on activated canonical Wnt signaling we performed several experiments employing Wnt3a stimulation and siRNA mediated beta-catenin knockdown.The hallmark of Wnt canonical pathway is the accumulation and nuclear translocation of beta-catenin. We could show both, accumulation of beta-catenin in the cytoplasm as well as increased beta-catenin nuclear levels in RCFs stimulated with Wnt3a. Wnta3a-mediated activation of Wnt signaling resulted further in the upregulated expression of several genes, most prominently Axin2 and Cyclin B1. We could further link Wnt/beta-catenin signaling with elevated collagen synthesis as well as increased cardiac fibroblast proliferation, two fundamental processes of myocardial fibrosis. We showed that Wnt3a stimulation leads to elevated mRNA levels of Collagens 1, 3 and 4 as well as total collagen synthesis in RCFs. Additionally we could observe increased collagen secretion. In accordance, siRNA-mediated beta-catenin knockdown resulted in decreased collagen expression. We further showed that Wnt3a stimulation was sufficient to increase the levels of expression of two Wnt/beta-catenin downstream genes - Cyclin D1 and c-Myc, both of which positively regulate cell proliferation. Likewise, Wnt3a stimulation and LiCl treatment resulted in significantly elevated rates of BrdU incorporation as compared to control. Finally, beta-catenin knockdown resulted in reduction in DNA synthesis rates as compared to scrambled siRNA control.In order to confirm our findings in vivo we recruited BAT-Gal reporter mice and subjected them to pulmonary artery banding procedure. Activation of Wnt-canonical pathway was assessed by beta-Galactosidase nuclear staining of cryosections derived from those animals. Although beta-Galactosidase positive cells were present in all included groups, we observed a substantially greater amount of those cells in the right ventricles of rats subjected to PAB. Thus, activation of Wnt/beta-catenin signaling pathway occurs in vivo and we can conclude that this signaling is important for the development of right ventricular remodeling and could eventually offer new treatment strategies. Rechtsventrikuläres Remodeling bezeichnet die Veränderungen von Größe, Form und Funktion des rechten Herzens nach Herzschädigung oder veränderten hämodynamischen Verhältnissen. Es ist eine fortschreitende Erkrankung, die mit mehreren Krankheiten, einschließlich pulmonaler Hypertonie (PH), verbunden ist. Es ist auch ein führender Indikator für die Entwicklung des rechten Herzversagens und Tod. Dennoch wurde bis vor kurzem die Bedeutung der rechtsventrikulären Funktion in Gesundheit und Krankheit oft unterschätzt. Frühere Studien zeigten, dass der Wnt-Signalweg eine wichtige Rolle bei dem linksventrikulären Remodeling spielt. Während die gesamte vorhandene Literatur die Auswirkungen dieser Signalkaskade in maladaptivem Wachstum des linken Ventrikels beschreibt, ist seine Rolle in der Hypertrophie des rechten Herzens bislang unbekannt. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass der kanonische Wnt-Signalweg auch eine Rolle bei der Entwicklung der rechtsventrikulären Hypertrophie spielt.In dieser Studie haben wir Tiermodelle der rechtsventrikulären Hypertrophie verwendet und charakterisiert (PAB, pulmonalarterielles Banding; MCT, Monocrotalin induzierte PH). Beide Modelle zeigen eine erhebliche Hypertrophie des rechten Herzens, was durch Erhöhung des RV/LV+S Verhältnisses sowie durch mRNA-Expression von bekannten hypertrophen Markern charakterisiert ist. Zusätzlich zeigen rechte Ventrikel aus beiden Tiermodellen fortgeschrittene fibrotische Veränderungen.Wir konnten eine Hochregulation von mehreren Wnt-Signalmolekülen, darunter beta-Catenin, GSK3beta und Frizzled-Rezeptoren, auf mRNA-Ebene in hypertrophierten rechten Ventrikeln der PAB Tieren zeigen. Auf Proteinebene konnten wir erhöhte Mengen an beta-Catenin und GSK3beta nachweisen. Ebenso fanden wir erhöhte mRNA-Spiegel von GSK3beta und Fz2 Rezeptoren in den rechten Ventrikeln von MCT-Ratten. beta-Catenin und GSK3beta Proteinmengen zeigten in diesem Modell allerdings nur eine Tendenz der Erhöhung. Darüber hinaus fanden wir eine signifikant erhöhte Expression von beta-Catenin in kardialen Fibroblasten aus der rechten Herzkammer der PAB Tieren im Vergleich zu Sham-RVs, wasbedeutet, dass diese Zellen, zumindest zum Teil, verantwortlich für die beobachteten Veränderungen sein könnten. Basierend auf BrdU-Inkorporation Experimenten, haben wir herausgefunden, dass die rechte Herzkammer eine erhöhte Proliferation von Fibroblasten aufwies.Das Kennzeichen des kanonischen Wnt-Signalwegs ist eine Akkumulation und Kerntranslokation von beta-Catenin. Wir zeigten sowohl die Akkumulation von beta-Catenin im Zytoplasma als auch erhöhte beta-Catenin Lokalisation im Kern nach Stimulation mit Wnt3a. Wnta3a-vermittelte Aktivierung der Wnt-Signalweg führte weiter in die hochregulierten Expression verschiedener Gene, besonders Axin2 und Cyclin B1. Wir konnten weiterhin den Wnt/beta-Catenin-Signalweg mit erhöhter Kollagen-Synthese sowie mit erhöhter kardialer Fibroblasten-Proliferation (zwei grundlegender Prozesse der myokardialen Fibrose) verknüpfen. Die Wnt3a Stimulation führt zu erhöhter Expression der Kollagene 1, 3 und 4 sowie der gesamten Kollagensynthese in kardialen Fibroblasten Ebenfalls führte der siRNA-vermittelte beta-catenin-Knockdown zu einer verminderten Kollagen Expression. Weiterhin zeigten wir, dass eine Wnt3a Stimulierung ausreichend war, um das Niveau der Expression von zwei Wnt/beta-catenin regulierten Genen, nämlich Cyclin-D1 und c-Myc, die beide positive Regulatoren der Zellproliferation sind, zu erhöhen. Ebenso ergab Wnt3a Stimulierung und LiCl Behandlung signifikant erhöhte Raten des BrdU- Inkorporation im Vergleich zur Kontrolle. Schließlich führte der beta-Catenin-Knockdown zu einer Verringerung der DNA-Synthese im Vergleich zur Kontrolle.Um unsere Befunde in vivo zu bestätigen, wurden BAT-Gal Reporter-Mäuse einer Pulmonalarterien-Stenose (PAB) unterzogen. Die Aktivierung des kanonischen Wnt- Wegs wurde durch beta-Galactosidase Kernfärbung von Kryoschnitten von diesen Tieren beurteilt. Obwohl beta-Galactosidase-positive Zellen in allen Gruppen anwesend waren, stellten wir eine wesentlich größere Menge dieser Zellen in den rechten Ventrikeln von PAB Ratten fest. Somit erfolgt die Aktivierung der Wnt/beta-Catenin-Signalweg in vivo und wir können feststellen, dass dieses Signal wichtig für das Remodeling des rechten Ventrikels- ist, was therapeutisch genutzt werden kann.