Klonierung und Expression des anti-VEGF-Moleküls RA-01 in vitro

Abstract

Neovaskuläre Erkrankungen der Netzhaut, wie die altersabhängige Makuladegeneration oder die diabetische Retinopathie, nehmen in der zunehmend älter werdenden Bevölkerung rapide zu. Grundlage der neovaskulären Erkrankungen ist ein überschießen¬des Blutgefäßwachstum in die Retina ausgelöst durch eine gesteigerte Aktivität des vascular endothelial growth factor (VEGF). Die aktuelle Therapiemethode besteht in der monatlich zu wiederholenden intravitrealen Injektion von anti-VEGF Molekülen wie Bevacizumab oder Ranibizumab. Der Nachteil dieser Behandlung ist jedoch der invasive Charakter der intravitrealen Injektion sowie die hohe finanzielle Belastung für die Patienten und das Gesundheitssystem. Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines Expressionssystems, mit dem das anti-VEGF F(ab)-Molekül Ranibizumab (RA-01) in eukaryotischen Zellen produziert werden kann.Die DNA Sequenz beider Peptide des F(ab) Fragmentes wurden für eine Expression in eukaryotischen Zellen durch Basenmodifizierung, Anhängen einer sekretorischen Leadersequenz und der Generierung bestimmter Enzymschnittstellen optimiert. Zwischen die DNA Sequenzen wurde eine internal ribosomal entry site (IRES) kloniert, um eine gleichzeitig Expression beider Peptide zu gewährleisten. Die Plasmide wurden in HEK293, HELA und arpe19 Zellkulturen transfiziert und das exprimierte Protein im Überstand per Western blot detektiert. Ein Ranibizumab spezifischer ELISA wurde entwickelt, um die Konzentration von RA-01 im Überstand messen zu können. Die biologische Aktivität von RA-01 wurde in einem human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) planar migration assay nachgewiesen.RA-01 konnte im Überstand von allen getesteten Zellkulturen nach Transfizierung detektiert werden. Aufgrund der höchsten Transfektionsrate wurden für die Produktion des Proteins für weitere biologische Messungen HEK293 Zellen transfiziert. Die Konzentration des Proteins konnte per ELISA gemessen werden (0,378µg/ml). Eine Konzentration von 37,8ng RA-01 konnte im HUVEC Migrationsassay die VEGF induzierte Migration um 50% hem¬men, ähnlich der Hemmungsaktivität von 100ng kommerziell erhältlichem Ranibizumab (Lucentis®).In dieser Arbeit wurde somit erfolgreich ein biologisch aktives anti-VEGF F(ab) Fragment in eukaryotischen Zellen in vitro hergestellt. Die Aktivität von RA-01 ist mindestens so hoch wie rekombinant in Bakterien hergestelltes, kommerziell erhältliches Ranibizumab. Somit kann zukünftig unter Nutzung vorhandener Transfer- und Regulationssysteme RA-01 in vivo in der Retina hergestellt werden. Diese neue Behandlungsmethode könnte zukünftig die regelmäßige intraokuläre Injektion von anti-VEGF Molekülen ersetzen und einen kosten-günstigeren und weniger invasiven Therapie der neovaskulären Erkrankungen der Netzhaut darstellen. Neovascular diseases of the retina, like the age-related macular degeneration or diabetic retinopathy, play an increasingly important role in the aging population. The pathogenetic mechanism of such neovascular diseases is an excessive and uncontrolled growth of blood vessels in the retina caused by the increased activity of vascular endothelial growth factor (VEGF). The current therapy of choice consists of monthly intraocular injections of anti-VEGF molecules, such as Bevacizumab or Ranibizumab. The disadvantage of this treatment is the invasive character of the intravitreal injection and the high financial burden for the patient and the healthcare system. The purpose of this study is to develop an expression system in order to produce the anti-VEGF F(ab) molecule Ranibizumab (RA-01) in eukaryotic cells.The DNA sequence of both peptides of the F(ab) fragment were optimized for expression in eukaryotic cells by modifying the base composition, adding a secretory leader sequence, and generating certain enzyme cleavage sites. An internal ribosomal entry site (IRES) was cloned between the DNA sequences in order to ensure a simultaneous expression of both peptides. The plasmids were transfected into HEK 293, HeLa and arpe 19 cell cultures and the target protein was detected in the supernatant by Western blot. A Ranibizumab specific ELISA was developed to measure the concentration of RA-01. The biological activity of RA-01 was detected in a human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) planar migration assay. After transfection, RA-01 was detected in the supernatant of all tested cell cultures. Due to the highest transfection rate, HEK 293 cells were used for further biological measurements. The protein concentration could successfully be measured by ELISA (0.378 µg/ml). A concentration of 37.8 ng RA-01 was sufficient to inhibit the VEGF-induced migration by 50% in the HUVEC migration assay, similar to the inhibitory activity of 100 ng of commercially available Ranibizumab (Lucentis®). This work demonstrates the successful expression of a biologically active anti-VEGF F(ab) fragment in eukaryotic cells in vitro. The activity of RA-01 is at least as high as commercially available Ranibizumab recombinantly produced in bacterial cells. In the future, RA-01 may be manufactured in vivo in the retina using existing transfer and regulatory systems. This new treatment could replace the regular intraocular injection of anti-VEGF molecules and would be a cheaper and less invasive treatment of neovascular diseases of the retina.