Pharmakologie und Signaltransduktion von Kininrezeptoren in Peritubulärzellen des Rattenhodens

Abstract

In der Literatur konnten alle Komponenten eines funktionierenden Kallikrein-Kinin-Systems im männlichen Reproduktionstrakt nachgewiesen werden. Die Expression der einzelnen Komponenten hängt dabei vom Alter des Tieres und vom Stadium der Spermatogenese ab. Dies lässt eine Beteiligung des Kallikrein-Kininsystem an der Regulation der Spermatogenese vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den bereits in Peritubulärzellen aus dem Testis praepubertärer Ratten nachgewiesenen B2 Rezeptor pharmakologisch zu charakterisieren und auf nachgeschaltete Signaltransduktionswege zu untersuchen. Alle Versuche wurden an Peritubulärzellen durchgeführt, die in Primärkultur aus den Testis praepubertärer Ratten isoliert wurden. Bei den Versuchen zur Signaltransduktion wurden die Zellen mit Bradykinin und geeigneten Kontrollen stimuliert und anschließend lysiert. Das Lysat wurde dann per ELISA, RIA bzw. Westernblot untersucht, um Rückschlüsse auf die Signaltransduktionsmechanismen ziehen zu können. Die pharmakologische Charakterisierung erfolgte durch Einsatz von [3H] Bradykinin. Adhärente Peritubulärzellen wurden mit ansteigenden Tracerkonzentrationen inkubiert, um die Sättigbarkeit zu demonstrieren und die Rezeptorbindung zu charakterisieren. Die pharmakologische Spezifität wurde durch Verdrängungsexperimente mit den spezifischen Antagonisten HOE140 bzw. Des-Arg-HOE140 nachgewiesen. Nach Stimulation des B2R mit Bradykinin konnte eine dosisabhängige signifikant erhöhte IP3 Konzentration gemessen werden. Der Gehalt der Peritubulärzellen an cAMP und cGMP blieb hingegen unverändert. Mit Westernblotuntersuchungen wurden durch Bradykinin induzierte Tyrosinphosphorylierungen im Bereich 100, 60, 40, 24, 22 und unter 10kDa nachgewiesen. Das Serin- und Threoninphosphorylierungsmuster zeigte dagegen keine Änderung nach Stimulation mit Bradykinin. An pharmakologischen Parametern konnte eine Dissoziationskonstante Kd von 1,13nM und eine maximale Rezeptorendichte Bmax von 22,34fmol / mg Protein bestimmt werden. Der ermittelte Hill Koeffizient war 0,97. Die Werte für die mittlere Hemmkonzentration IC50 waren 7,9nM für HOE 140 bzw. 302nM für Des-Arg-HOE140. Die Form der ermittelten Sättigungskurve und des zugehörigen Scatchard Plot sowie der bestimmte Hillkoeffizient von 0,97 sprechen dafür, dass die Bradykinin Bindung an Peritubulärzellen an einer spezifischen Bindungsstelle erfolgt. Durch den Einsatz spezifischer Antagonisten konnte der B2 Rezeptor als Bindungsstelle verifiziert werden. Die ermittelten pharmakologischen Parameter des B2R in Peritubulärzellen der Ratte waren mit den in der Literatur für andere Gewebe publizierten Werten vergleichbar. Die Signaltransduktion des B2 Rezeptors in Peritubulärzellen erfolgt unserer Ansicht nach über eine Spaltung von Phosphatidyl inositol-4,5-diphosphat in Diacylglycerol und Inositoltriphosphat, welches wiederum zu einer Entleerung der intrazellulären Calcium- Speicher führt. Die veränderte Ca2+ Konzentration aktiviert dann verschieden Kinasen, was sich in einem geänderten Phosphorylierungsmuster niederschlägt. Auch eine direkte Aktivierung von verschiedenen Kinasen durch den B2R scheint wahrscheinlich. Previous studies have shown that all components of a functional Kallikrein-Kinin system can be detected in the male reproductive tract. Expression of these individual components depends on the animal´s age and the stage of spermatogenesis. This may suggest an involvement of the Kallikrein-Kinin system in the regulation of spermatogenesis. Functional B2 receptors were detected in peritubular cells of the testes of prepubescent rats. The objective of this work was to pharmacologically characterize these B2 rezeptors and to investigate their downstream signal transduction pathways. All experiments were conducted using peritubular cells that had been isolated in primary culture from the testes of prepubescent rats. In the signal transduction experiments the cells were first stimulated using bradykinin and suitable controls and then subsequently lysed. The lysate was analyzed using ELISA, RIA or western blots to gain insights into the underlying signal transduction mechanisms. The pharmacological characterization was carried out using radioactive [3H] bradykinin. Adherent peritubular cells were incubated with rising tracer concentrations to demonstrate saturability and to characterize the receptor binding. The pharmacological specificity was demonstrated using substitution experiments with the specific antagonists HOE140 and Des-Arg HOE 140, respectively. Following stimulation of the B2R with bradykinin, a dose dependent significantly elevated IP3 concentration was measured. In contrast, the concentration of cAMP and cGMP in peritubular cells was not affected. Using western blots, we demonstrated bradykinin-induced tyrosin phosphorylations in the 100, 60, 40, 24, 22 kDa range and also below10 kDa. In contrast, no change was seen in serin and threonin phosphorylation patterns after bradykinin stimulation. As pharmacological parameters we determined a dissociation constant Kd of 1.13 and a maximum receptor density Bmax of 22,34fmol/mg protein. The Hill coefficient was calculatedto be 0.97. The measurements for the medium inhibitor concentration IC50 yielded 7.9nM for HOE and 302 nM for Des-Arg-HOE140, respectively. The shape of the saturation curve, the corresponding Scatchard plot and the value found for the Hill coefficient suggest that bradykinin binds to peritubular cells at one specific binding location. Using specific antagonists, we were able to identify the B2 receptor as this binding location. The measured pharmacological parameters of the B2R in peritubular cells of the rat were in excellent agreement with values published in literature for other tissue types. We conclude that the signal transduction of the B2 receptor in peritubular rat cells involves splitting Phosphatidyl inositol-4,5-diphosphate into Diacylglycerol and Inositoltriphosphate which in turn leads to a depletion of the intracellular calcium storage. The rising Ca2+ concentration then activates various kinases, which results in a modified phosphorylation pattern. In addition, a direct activation of different kinases by B2R appears probable.