Untersuchungen zur signalabhängigen Regulation der Enzymaktivität von Argonaut 2

Abstract

Argonaut 2 (Ago2) ist das katalytische Zentrum des RNA-induced silencing complex (RISC). Dieses Protein besitzt eine Endonukleaseaktivität und spaltet siRNA/mRNA- oder miRNA/mRNA-Hybride. Es kommt zu einer sequenzspezifischen posttranskriptionellen Genstilllegung (silencing), welche wichtig für die Regulation der Genexpression in nahezu allen Lebewesen ist. Dieser Prozess wird als RNA-Interferenz (RNAi) bezeichnet. Die Arbeitsgruppe Kracht identifizierte Ago2 als einen Interaktionspartner der MAP-Kinase JNK. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Zytostatika Cisplatin, Doxorubicin und Vinblastin, welche als gemeinsames Merkmal die Aktivierung von JNK haben, auf die Ago2 Aktivität untersucht. Hierzu wurde zunächst ein in vitro RISC-Assay etabliert. Mit diesem ist es möglich, die Aktivitätsänderungen eines rekombinanten GST-Ago2 in der An- oder Abwesenheit von Zellextrakten zu erfassen. Bisher war hierzu der Einsatz radioaktiv markierter RNAs nötig. Es wurde ein nicht-radioaktiver in vitro RISC-Assay etabliert und die Bedingungen zur Durchführung dieses Assays systematisch ausgetestet. Weiterhin wurde der Einfluss der Zytostatika auf die RISC-Aktivität in intakten Zellen mit Hilfe eines Luziferase-Reportergenassays bestimmt. Hierzu wurden in HEK293IL-1R-Zellen ein für Luziferase codierendes Plasmid und eine Luziferase-siRNA transfiziert. Im Anschluss wurden die Zellen mit Cisplatin, Doxorubicin und Vinblastin stimuliert und die Luziferaseaktivität gemessen. Es zeigte sich eine Aktivierung des RISC durch Cisplatin und Doxorubicin. Vinblastin hatte keinen Einfluss auf die RISC-Aktivität. Eine Überexpression von Ago2 führte zu keiner signifikanten Steigerung des Einflusses von Cisplatin, Doxorubicin und Vinblastin auf die Aktivität des RISC. Im Gegensatz zu den Zytostatika führten die JNK-Aktivatoren MEKK1 und ein TAK1kd-TAB1ad-Fusionsprotein in dem gleichen Assay zu einer Hemmung der RISC-Aktivität. Zusammenfassend konnte somit in dieser Arbeit Befunde erhoben werden, die daraufhin deuten, dass die Aktivität von RNAsen aus dem RISC Komplex durch Stresssignalwege moduliert werden. Diese Beobachtungen könnten für das Verständnis der vielfältigen molekularen Wirkungen von zellschädigenden Zytostatika relevant sein. Argonaute 2 (Ago2) is the catalytic core of the RNA-induced silencing complex (RISC). The protein contains an endonuclease activity and cleaves siRNA/mRNA or miRNA/mRNA hybrids. This leads to a sequence specific post-transcriptional silencing, which is important for the regulation of gene expression in most species. This process is called RNA-interference (RNAi). The study group of Prof. Kracht identified Ago2 as a protein which interacts with the MAP kinase JNK. In this dissertation the influence of the JNK-acitvating cytostatic drugs cisplatin, doxorubicin and vinblastine on Ago2 activity was examined. First, an in vitro RISC assay was established. With this RISC assay it was possible to assess changes in activity of a recombinant GST-Ago2 in the presence or absence of cell extract proteins. So far, such assays required radioactively labeled RNAs. A non-radioactive in vitro RISC assay was established and assay conditions were systematically validated. Furthermore, the influence of cytostatic drugs on the RISC activity in intact cells was determined by a luciferase reporter gene assay. HEK293IL-1R cells were transfected with a plasmid encoding luciferase as well as a luciferase siRNA. Thereafter, cells were stimulated with cisplatin, doxorubicin or vinblastine and activity of luciferase was determined. There was an activation of RISC by cisplatin and doxorubicin. Vinblastine had no influence on RISC acitivity. Overexpression of Ago2 caused no significant changes in the effects of the cytostatic drugs on intracellular RISC activity. In contrast, the JNK activators MEKK1 and a TAK1kd-TAB1ad fusion protein inhibited RISC activity. In summary, the findings indicate that the activity of RNases of the RISC are modulated by stress signaling pathways. These results may be relevant for the understanding of the molecular effects of cytostatic drugs.