Mutationsscreening im RD3-Gen bei Patienten mit frühkindlichen und juvenilen Netzhautdegenerationen

Abstract

Die Lebersche kongenitale Amaurose (LCA) ist eine Form der hereditären frühkindlichen Netzhautdystrophie. Bei den betroffenen Patienten kommt es bereits im frühesten Kindesalter zu schweren degenerativen Veränderungen der Retina, die zu einem beträchtlichen Visusverlust und stark verminderten Antworten im Elektroretinogramm (ERG) führen. Ca. 70 % der Erkrankungsfälle lassen sich durch die derzeit 23 bekannten Gene erklären, welche im Falle einer Mutation eine LCA verursachen. Mutationen im RD3-Gen werden autosomal-rezessiv vererbt und führen zu einem besonders schweren Krankheitsverlauf (LCA Typ 12). Die ersten RD3-Patienten konnten 2006 und 2012 beschrieben werden.In der vorliegenden Arbeit wurden DNA-Proben eines systematisch ausgewählten Kollektivs von 88 Netzhautdystrophie-Patienten auf Mutationen im RD3-Gen untersucht, um eine Aussage zur Häufigkeit solcher Mutationen als Ursache der LCA zu treffen. Die in das Screening eingeschlossenen Patienten wurden dabei nach zwei unterschiedlichen Aspekten ausgewählt:1. In der Annahme einer Genotyp-Phänotyp-Korrelation bei Patienten mit RD3-Mutationen wurden aus der Datenbank des Labors für Molekulare Ophthalmologie in Gießen gezielt 32 Patienten (mit noch unbekannter Krankheitsursache) ausgewählt, die den bereits beschriebenen RD3-Patienten in ihren klinischen Befunden (insbesondere hinsichtlich Visusverlust und ERG) möglichst ähnelten, sowie weitere 33 Patienten mit schweren Netzhautdystrophien außerhalb dieses engen Rasters (Patientengruppe 1).2. Ferner wurden 23 Patienten mit Sequenzänderungen im GUCY2D-Gen (ursächliches Gen für LCA Typ 1) auf zusätzliche RD3-Mutationen untersucht (Patientengruppe 2). Da die Genprodukte von RD3 und GUCY2D im Rahmen der Phototransduktion in den Photorezeptoren interagieren, vermuteten wir, dass RD3-Mutationen möglicherweise einen Einfluss auf den Schweregrad des klinischen Erscheinungsbildes von GUCY2D-Patienten ausüben könnten.In dieser gezielten Auswahl der Patienten nach phänotypischen bzw. genotypischen Kriterien unterscheidet sich die vorliegende Arbeit ebenso von den vorangehenden RD3-Screening-Studien wie in der ethnischen Zusammensetzung des hier untersuchten Patientenkollektivs, welche einen weiteren möglichen Einflussfaktor auf die Häufigkeit von RD3-Mutationen darstellt.Das RD3-Gen der betreffenden Patienten wurde zunächst durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert, dann mittels Agarosegel-Elektrophorese isoliert und anschließend sequenziert. Dabei wurden im untersuchten Patientenkollektiv bei 34 der 88 Patienten Sequenzänderungen im RD3-Gen identifiziert. Dabei handelte es ich um sieben unterschiedliche Veränderungen der Basenfolge: c.5A>T (p.H2L), c.141C>T (p.R47C), c.170G>T (p.G57V), c.296+28G>A, c.297-124G>A, c.297-86A>T und c.486C>T. Die gefundenen Sequenzänderungen kamen allerdings in keinem der Fälle als Ursache der vorliegenden Netzhautdystrophie in Frage, da es sich um unwirksame Polymorphismen (in Form von heterozygoten Veränderungen bzw. Veränderungen innerhalb von Introns) handelte.Dieses Ergebnis legt nahe, dass Mutationen im RD3-Gen als eine extrem seltene Ursache der LCA anzusehen sind und steht damit im Einklang mit den Aussagen bisheriger Studien. Leber s congenital amaurosis (LCA) is a form of hereditary early onset retinal dystrophy. Patients affected by this disease show severe degenerative alterations of the retina in earliest infancy leading to serious visual impairment and severely reduced responses in the electroretinography (ERG). About 70 % of the cases can be explained by the currently known 23 genes which in the mutated state cause LCA. Mutations in the RD3 gene reveal an autosomal-recessive inheritance and lead to a particular severe course of the disease (LCA type 12). The first RD3 patients were described in 2006 and 2012.In the present study the DNA of 88 systematically selected patients with retinal dystrophy was tested for changes in the RD3 gene to get information about the incidence of such mutations as a reason for the disease. The patients were selected by two different aspects:Group 1: Presuming a genotype-phenotype correlation in patients with RD3 mutations, 32 patients (with to date unknown cause of their disease) were chosen for mutation screening from the database of the Laboratory of Molecular Ophthalmology in Gießen. These patients resem¬ble to the clinical features of the so far described RD3 patients (especially concerning vision loss and ERG). In addition the DNA of 33 other patients with severe forms of retinal degeneration outside of these strict criteria were included in the screening.Group 2: Furthermore 23 patients with sequence changes in the GUCY2D gene (causing LCA type 1) were tested for additional RD3 mutations. Due to the interaction of the gene products of RD3 und GUCY2D in the process of phototransduction a possible influence of RD3 mutations on the severity of the GUCY2D patients clinical appearance was supposed.The systematical selection of the patients following phenotypical respectively genotypical criteria distinguishes the present work from former studies as well as its ethnical distribution that represents a possible influence factor on the incidence of RD3 mutations.The RD3 gene of the selected patients was first amplified by polymerase chain reaction, then isolated by an agarose gel electrophoresis and finally sequenced. In this process RD3 sequence changes were identified in 34 of the 88 patients. Seven different alterations of the base order were detected: c.5A>T (p.H2L), c.141C>T (p.R47C), c.170G>T (p.G57V), c.296+28G>A, c.297-124G>A, c.297-86A>T and c.486C>T. However, the mentioned sequence changes could not be regarded to cause the patients retinal dystrophies, but represented non-effective polymorphisms (alterations in the heterozygous state respectively located in introns). The results reveals that mutations in the RD3 gene seem to be an extremely rare cause of LCA. This conclusion is in accord with the statements of the former studies on that subject.