Untersuchungen zum Knochenstoffwechsel und zur Zytokin-Expression im spongiösen Knochen des Menschen nach Fragilitätsfraktur des Schenkelhalses

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, die Expressionen verschiedener lokaler Faktoren des Knochenmikromilieus zu evaluieren, um differenzierte Informationen über die Zytokin- und Stoffwechselsituation des durch Fragilitätsfrakturen charakterisierten Knochens zu erhalten. Hierzu wurde humane Hüftkopfspongiosa mittels RealTime-PCR auf die Expressionsprofile ausgewählter Zytokine und Mediatoren des Knochenstoffwechsels untersucht. Die insgesamt 39 Spongiosaproben entstammten Frauen (n = 21) und Männern (n = 18) mit einem Lebensalter von mindestens 60 Jahren, die sich auf Grund einer Schenkelhalsfraktur oder einer Coxarthrose einer Resektion des Oberschenkelkopfes unterziehen mussten. Die Untersuchungen erfolgten im Rahmen des Sonderforschungsbereich/Transregio 79 Werkstoffe für die Geweberegeneration im systemisch erkrankten Knochen , Teilprojekt B2 Charakterisierung des Kallus im systemisch erkrankten Knochen am Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie der Justus-Liebig-Universität Gießen. Ziel dieses interdisziplinären Forschungsprojektes ist es, neue Ätiologie-adaptierte Knochenersatzmaterialien und Implantatwerkstoffe für den systemisch erkrankten Knochen des Menschen zu generieren (Sonderforschungsbereich/Transregio 79, 2010-2014).Das Erkenntnisinteresse der vorliegenden Arbeit lag in der Ermittlung von Expressionsprofilen der pro-inflammatorischen und die Osteoklastengenese stimulierenden Interleukine 1 und 6, der anti-inflammatorischen knochenprotektiven Interleukine 4, 10 und 13 sowie der den Knochenstoffwechsel regulierenden Faktoren RANKL und OPG. Die aus den Proben extrahierte mRNA wurde mittels RT-qPCR quantifiziert, um die Expressionen der genannten Zytokine und Mediatoren zu bestimmen.Die Ergebnisse legen auf Grund geschlechtsunspezifischer, niedriger Expressionsprofile und dem Durchschnittsalter der Patientenpopulation eine Low-Turnover-Osteoporose bei den untersuchten Patienten nahe. Diese Annahme fand durch morphologische Untersuchungen histologischer Schnitte der beprobten Hüftköpfe ihre Bestätigung. Des Weiteren weisen die signifikant höheren IL-Expressionen (IL 1, 6 und 10) in der Frakturgruppe, entsprechend dem Ablauf einer Frakturheilung, auf einen bedeutenden Einfluss des Frakturgeschehens im Rahmen der Hochregulation dieser Zytokine hin. Im Gegensatz dazu scheint die Bedeutung der IL 4 und 13 im skelletalen Mikromilieu eine untergeordnete Rolle zu spielen. So waren diese anti-inflammatorischen IL, die in das Studiendesign auf Grund ihrer Beteiligung an Fremdkörperreaktionen und der damit verbundenen Fusion einkerniger Makrophagen zu mehrkernigen Biomaterial-adhärenten foreign body giant cells aufgenommen wurden, in keiner der untersuchten Knochenproben in detektierbaren mRNA-Mengen exprimiert.Um einen Hinweis auf die Knochenstoffwechselsituation der Patienten zu erhalten, wurde aus den Expressionswerten von RANKL und OPG ihre Ratio (RANKL/OPG) ermittelt und dadurch zwischen ausgewogenen (RANKL/OPG kleiner gleich 1, n = 15) und unausgeglichenen (RANKL/OPG > 1, n = 24) Knochenumbauraten unterschieden. Auffällig hierbei war insbesondere, dass lediglich 3 der 17 Patienten mit einer Fraktur einen ausgeglichenen Knochenstatus und somit die Mehrzahl der Frakturpatienten einen potenziellen Status des Knochenverlustes aufwiesen. Da RANKL/OPG im Rahmen der einfaktoriellen nichtparametrischen Datenanalyse keine Korrelation zu den hoch-signifikant mit einem Frakturgeschehen korrelierten pro-inflammatorischen IL 1 und 6 zeigte, konnte eine rein frakturbedingte Kausalität hoher RANKL/OPG-Quotienten (> 1) ausgeschlossen werden. Dementsprechend ergab die explorative dreifaktorielle Varianzanalyse keine Wechselwirkung von RANKL/OPG mit der Frakturgruppe. Entsprechend bekannter Mechanismen der Knochenheilung des fragilen Knochens, waren die pro-inflammatorischen IL 1 und 6 dennoch im Rahmen explorativer mehrfaktorieller Varianzanalysen positiv signifikant und IL 6 zusätzlich in der einfaktoriellen nichtparametrischen Analyse statistisch auffällig mit RANKL/OPG korreliert. Auch zeigte das anti-inflammatorische IL 10 bei der einfaktoriellen nichtparametrischen Analyse, im Sinne eines möglichen kompensatorischen Effektes, eine positive Signifikanz mit RANKL/OPG.Zusammenfassend konnte die vorliegende Arbeit zeigen, dass die pro-inflammatorischen IL 1und 6 sowie das anti-inflammatorische IL 10 im Mikromilieu des frakturierten und von Knochenverlust gekennzeichneten Knochens älterer Menschen vermehrt exprimiert sind, während IL 4 und 13 prae implantationem keine relevante Rolle spielen. Da die ermittelten Expressionsprofile der Interleukine 1, 6 und 10 prinzipiell mit den während der Heilung im gesunden Knochen dokumentierten mRNA-Mustern übereinstimmen, ist von einer konservierten Heilungskaskade im fragilen spongiösen Knochen auszugehen. Für die Entwicklung neuer Knochenersatzmaterialien und Implantatwerkstoffe für den systemisch erkrankten und von Fragilitätsfrakturen betroffenen Knochen sind genaue Kenntnisse über die lokale Zytokin- und Stoffwechselsituation des Zielgewebes von großer Bedeutung. Hierzu leisten die Ergebnisse dieser Arbeit einen wichtigen Beitrag. In the present study the expression of specific cytokines and important regulatory molecules of trabecular bone of patients with a fracture of the femoral neck and with osteoarthritis (used as a control) has been investigated by means of quantitative real time PCR. 39 bone samples were taken from femoral heads from men (n = 18) and women (n = 21) with a minimum age of sixty years subjected to hip-joint replacement surgery for femoral neck replacement (n = 17) or because of osteoarthritis (n = 22). mRNA was extracted from the bone samples and the expression of the pro-inflammatory interleukins 1 and 6, the anti-inflammatory interleukins 4, 10 and 13, and of RANKL and OPG, both of which are important molecules associated with bone remodeling was evaluated. The investigations were performed in the course of the Collaborative Research Center TRR 79 funded by DFG Materials for tissue regeneration of systemically altered bone , Project B2 Characterization of callus tissue within systemically altered bone at the Institute of Veterinary-Anatomy, -Histology und -Embryology of the Justus-Liebig-University, Giessen. The aim of the research project is the generation of etiology-adapted bone substitutes and implants for systemically altered human bone.The results of the present study suggest due to low, gender-unrelated expression-profiles as well as to the mean age of the study group, a low-turnover osteoporosis of the patients suffering a femoral fracture. This was confirmed by histological analyses of bone samples and by CT. The expression of IL 1, 6 and 10 was significantly increased in the fracture group compared to osteoarthritis-patients documenting a cytokine pattern within fractured bone that refer to conserved bone healing following fragility fracture. In contrast IL 4 and 13 appear to play a minor role in the fractured bone, because the mRNA of both anti-inflammatory interleukins was not detectable. These interleukins were included in this study due to their capacity to stimulate formation of biomaterial-adherent foreign body giant cells after implantation. In order to get information about the patients bone metabolism we calculated the ratio of RANKL and OPG (RANKL/OPG). Based upon this calculation it was possible to differentiate between balanced (RANKL/OPG less than or equal to 1, n = 15) and imbalanced (RANKL/OPG > 1, n = 24) bone status. Only 3 fracture-patients revealed a balanced ratio of RANKL and OPG (3 out of 17), whereas the majority showed a ratio greater than 1 referring to a stage of bone loss. The non-parametrical single factor data analysis showed no significant correlation of the RANKL/OPG ratio with the pro- inflammatory IL 1 and 6 which were significantly elevated in fractured bone samples. Therefore, it can be assumed that a high RANKL/OPG ratio (> 1) was not exclusively caused by the fracture event. Accordingly, the exploratory three-factor analysis of variance showed no correlation between the RANKL/OPG ratio and the fractured bone. It could be further shown that increasing levels of IL 1 and 6 were significantly correlated with the RANKL/OPG ratio according to the exploratory multivariate analysis of variance. In addition, IL 6 was markedly, but not significantly correlated with the RANKL/OPG ratio according to the non-parametric single factor analysis. The non-parametric single factor analysis revealed also a significant correlation of IL 10 expression with the RANKL/OPG ratio which can be regarded as a compensatory effect.In sum, the present study demonstrates increased expression of the pro- inflammatory interleukins 1 and 6 and of the anti-inflammatory IL 10 within fractured bone referring to a well conserved bone healing cascade following fragility fracture. However, IL 4 and 13 were not detectable. An important prerequisite for the generation of materials with a high degree of biocompatibility is the knowledge about cells and soluble factors predominating within the microenvironment of the tissue. Therefore, the present results provide the basis for generating these materials especially of those designated for the systemically altered bone.