Untersuchungen zur Regulation des Natrium-Iodid-Symporters (NIS)und der Thyreoperoxidase (TPO) durch die sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs)

Abstract

Eine Dysfunktion des Natrium-Iodid-Symporters (NIS) oder der Thyreoperoxidase (TPO) führen zu einer beeinträchtigten Synthese der Schilddrüsenhormone, aus der das klinische Bild der Hypothyreose hervorgeht. Transkriptionell reguliert werden die Gene des NIS und der TPO primär über das Thyreotropin (TSH, Thyreoidea stimulierendes Hormon), jedoch mehren sich die Hinweise, dass die Gene des NIS und der TPO auch einer TSH-unabhängigen Regulation unterliegen. Erste Untersuchungen deuten auf eine mögliche Rolle der sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) in der Regulation des NIS und der TPO hin. Das Ziel dieser Arbeit war, zu untersuchen, ob die Gene des NIS und der TPO in einer SREBP-isoformspezifischen Weise reguliert werden, und die Identifizierung ein oder mehrerer funktioneller SREBP-responsiver Elemente in den regulatorischen Regionen beider Gene. RNA-Interferenz-Experimente in thyroidalen FRTL-5-Zellen zeigten eine SREBP-isoformunspezifische Regulation des NIS- und TPO-Gens, basierend auf der Beobachtung, dass der sequenzspezifische knockdown von SREBP-1 und SREBP-2 zu einer Suppression des NIS und der TPO führte. Zudem bestätigten die in HepG2-Zellen durchgeführten Reportergenstudien die direkte SREBP-abhängige Regulation beider Gene. Nach Überexpression des aktiven SREBP-1c und des aktiven SREBP-2 konnten die generierten NIS-und TPO-Reportergene transaktiviert werden. In den folgenden Deletions- und Mutationsanalysen konnte ein kritisches SREBP-responsives Bindungselement in der 5´-untranslatierten Region (5´-UTR) des NIS-Gens und ein überlappendes SREBP-responsives Element im ersten Intron des TPO-Gens lokalisiert werden. Deren funktionelle Bedeutung konnte zusätzlich durch den Nachweis einer in vitro- und in vivo-Bindung von SREBP-1c/-2 erhärtet werden. Ferner erbrachte der Sequenzvergleich der 5´-UTR des NIS-Gens und des ersten Introns des TPO-Gens, einschließlich der identifizierten funktionellen SREs, zwischen Ratte und Maus eine hohe Homologie, was demnach auf eine wichtige regulierende Funktion dieser Regionen hindeutet. Neben der beschriebenen transkriptionellen Regulation des NIS-Gens durch die SREBPs konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass Sterole Einfluss auf die Schilddrüsenhormonsynthese nehmen können, da nach sterol-induzierter Inhibierung der aktiven SREBPs in den thyroidalen FRTL-5-Zellen die NIS-spezifische Iodidaufnahme moderat vermindert werden konnte. Die Identifizierung des NIS und der TPO als direkte Zielgene der sterolsensitiven SREBPs zeigt einen neuartigen Regulationsweg. Somit stellen SREBPs potenzielle Zielstrukturen für zukünftige therapeutische Interventionen bei Schilddrüsendysfunktionen, wie etwa eine Hypothyreose, dar. Dysfunctions of the sodium iodide symporter (NIS) or the thyroperoxidase (TPO) lead to an impairment of the synthesis of thyroid hormones resulting in hypothyreodism. The genes encoding NIS and TPO are transcriptionally regulated primarily by thyrotropin (TSH, Thyroid-stimulating hormone) but there is increasing evidence that these genes are also regulated by TSH-independent mechanisms. Recent studies could demonstrate a potential role of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) in the regulation of NIS and TPO. The aim of the present thesis was to explore, whether the NIS and TPO genes are regulated in a SREBP isoform-specific manner, and to identify one or more functional SREBP-responsive elements within the regulatory regions of both genes. RNA interference experiments in thyroidal FRTL-5 cells revealed a SREBP isoform unspecific regulation of the NIS and TPO gene, based on the observation that sequence-specific knockdown of both SREBP-1 and -2 led to suppression of both NIS and TPO. Furthermore, reporter gene studies in HepG2 cells confirmed direct regulation of both genes by SREBPs. Overexpression of SREBP-1c and SREBP-2 caused a strong transactivation of the generated NIS and TPO reporter genes. Following deletion and mutation analysis, one critical SREBP-responsive binding element in the 5´-untranslated region (5´-UTR) of the NIS gene and an overlapping SREBP-responsive element in the first intron of the TPO gene were identified. Their functional relevance could be substantiated by demonstrating in vitro- and in vivo-binding of SREBP-1c- and -2. Moreover, sequence alignment of NIS 5´-UTR and TPO first intron, including the identified functional SREs, between rat and mouse showed a high sequence homology being indicative for an important regulatory function. Besides providing evidence for the transcriptional regulation of the NIS gene by SREBPs, it was found that sterols influence thyroid hormone synthesis as evidenced by the observation that sterol-induced SREBP inhibition resulted in a moderate decrease of NIS-specific iodide uptake in FRTL-5 cells. The identification of NIS and TPO as direct target genes of the sterol-sensitive SREBPs represents a novel regulatory pathway. Therefore, SREBPs could be possible new targets for therapeutic interventions of thyroid dysfunctions such as hypothyreodism in future.