Funktionelle Charakterisierung der pestiviralen Ribonuklease E rns

Abstract

Die T2 Ribonuklease Erns ist ein Glykoprotein, das ausschließlich bei Pestiviren vorkommt. Es tritt sowohl als Strukturprotein als auch als sezerniertes Protein in Erscheinung. Während E rns für die Bildung von Viruspartikeln als essentiell beschrieben wurde, ist die Funktion der RNase für den viralen Lebenszyklus sowie die Pathogenese unbekannt. Um die Enzymfunktion von Erns zu analysieren, wurden drei experimentelle Ansätze gewählt: 1. Bestimmung der Substratspezifität, 2. Mutationsanalyse des aktiven Zentrums inklusive Modellierung des Proteins und 3. Einfluss von N-Glykosylierung auf die Enzymaktivität. zu 1 Die Spaltspezifität von Erns wurde auf der Grundlage von heteropolymeren RNA-Substraten in limitierenden Verdauen ermittelt. RNA-Fragmente, die nach limitierenden Verdauen durch Erns gebildet wurden, entsprechen einer Spaltung 5´ von Uridin (NpU). Für die Untersuchung der NpU Spaltstelle wurden einzelsträngige RNA-Moleküle (45-56 nt) eingesetzt, die sich nur an der N-Position unterscheiden (N= A, C, G oder U). Kinetische Bestimmungen der NpU Spaltung durch E rns ergaben Affinitätskonstanten zwischen 105 250 nM sowie einen geringen Substratumsatz von weniger als einem Molekül Substrat/ Molekül Enzym s-1. zu 2 Auf der Grundlage der Substratspezifität wurde ein RNase-Test für die Aktivitätsbestimmung von Erns-Mutanten entwickelt. Neben insgesamt 14 Mutationen im Bereich des aktiven Zentrums, die im Wesentlichen die Zugehörigkeit zur T2 RNase Familie bestätigten, wurden auch C-terminale Verkürzungen untersucht. Nach Verkürzung des C-Terminus um 87 Aminosäuren blieb die RNase-Aktivität des Erns erhalten. Dieses Ergebnis ist in Analogie zu einem Modell von Erns, das auf der Grundlage von RNase Rh erstellt wurde. Auch das Modell lässt die Eigenständigkeit einer RNase-Domäne erkennen, die etwa die N-terminale Hälfte des Proteins umfasst (aa 1-103). zu 3 Die Anheftung von Zuckermolekülen an die Asparaginreste der N-Glykosylierungsstellen wird durch die Substitution von Asn durch Gln verhindert. Nach Substitution einzelner bzw. mehrerer Asparagine wurden insgesamt 38 Erns-Mutanten erzeugt, und die Aktivitäten nach Expression in eukaryonten Zellen bestimmt. Während in Abwesenheit aller N-Glykosylierungsstellen keine RNase-Aktivität mehr nachgewiesen wurde, ist das Vorkommen von zwei N-Glykosylierungsstellen, NGS 1 und 5, für den Erhalt der enzymatischen Aktivität ausreichend. Die gleichen N-Glykosylierungsstellen sind auch für die Vermehrungsfähigkeit von KSPV in revers genetischen Experimenten essentiell. The T2 Ribonuclease Erns is a glycoprotein, which is only present in pestiviruses. Erns is a structural protein and it is also secreted from infected cells. While it is described that Erns is essential for the formation of viral particles, the function of the RNase-activity for the viral lifecycle or pathogenesis is unknown. To analyze the enzymatic function of Erns, three different experimental approaches were chosen: 1st determination of the substrate specificity, 2nd mutagenesis-studies with respect to the active site including modeling of Erns and 3rd influence of N-glycosylation on enzyme activity. 1st To detect the cleavage specificity of Erns a limited digest of heteropolymeric RNA-substrates was performed. Under suboptimal conditions Erns cleaves exclusivly phosphodiesterbonds 5´ of uridine bases (NpU). To analyze the NpU cleavage site, single stranded RNA molecules of 45-56 nts were synthesized. These substrates only differ in the base at the N-position (N= A, C, G oder U). Kinetic parameters of the NpU cleavage for all four substrates revealed Km values of 105 250 nM and a low turn over rate (less than one molecule substrate/ molecule enzyme s-1). 2nd Based on the substrate specificity an RNase-assay was established, which allowed the precise determination of the RNase-activity of various Erns-mutants. The results of 14 mutants with single amino acid exchanges in the active center mainly conformed the integration of Erns into the family of T2 RNases. In addition Erns was C-terminal truncated and the Rnase-activity was measured. The deletion of 87 C-terminal amino acids still led to an active RNase. These results conformed a model of Erns, which was designed based on the crystal structure of the T2 RNase Rh. According to the 3-D structure the N-terminal half of the protein forms an independent RNase domain (aa 1-103). 3rd Asn to Gln substitution abolishes the linkage of sugar molecules to the asparagine residue of N-glycosylation sites. Substitution of single, double or multiple asparagine residues resulted in 38 Erns-mutants. The Erns-mutants were expressed in eucaryotic cells and the RNase activity was analyzed. While the deletion of all N-glycosylation sites led to an inactive enzyme, a minimal set of two N-glycosylation sites, NGS 1 and 5, turned out to be sufficient for RNase activity. In a reverse genetic system the same minimal set was also essential for the detection of CSFV.