Investigations on the effects of peroxisome proliferator-activated receptors and of nuclear factor kappa B on novel organic cation transporter 2 and carnitine uptake in bovine kidney cells

Abstract

L-Carnitine is a water soluble metabolite, serving as an essential cofactor for fatty acid beta-oxidation by transferring long-chain fatty acids as acylcarnitine esters across the inner mitochondrial membrane. In the body, carnitine is derived from endogenous synthesis and from the intestinal absorption from the dietary sources. Tissues which cannot provide carnitine via endogenous synthesis, like skeletal muscle or myocardium, are dependent on carnitine uptake from the circulation. Carnitine transport is mediated by OCTN2, which is sodium-dependent and has a high-affinity to carnitine. OCTN2-mediated carnitine transport is also responsible for the tubular reabsorption of carnitine in the kidney and is therefore fundamental to maintaining normal carnitine levels in serum. Recent studies in rodents convincingly demonstrated that PPARalpha, which is a well-known central regulator of lipid metabolism and energy homeostasis, is an important transcriptional regulator of genes encoding OCTN2. Gene transcription by PPARalpha is initiated when a ligand, like fatty acids which are liberated from adipose tissue during energy deprivation and taken up into tissues during this state, or exogenous ligands such as fibrates (WY-14,643) bind to the LBD of this transcription factor. In contrast to rodents, little is known with regard to the regulation of OCTN2 by PPARalpha and its isoforms PPARbeta/delta and their roles for carnitine transport in cattle. PPARbeta/delta and PPARalpha have partially overlapping functions. For instance, they are central regulators of fatty acid catabolism since both subtypes control the expression of genes encoding proteins involved in cellular fatty acid uptake, intracellular fatty acid transport, mitochondrial fatty acid uptake, and mitochondrial and peroxisomal fatty acid oxidation. Although PPARs and NF-kappaB have a negative cross talk, in cattle both PPARs and NF-kappaB are activated during transition period. It has been confirmed that OCTN2 expression and carnitine uptake in human colonic epithelial cells are increased by NF-kappaB inducer TNFalpha. However, it is unclear whether NF-kappaB is able to alter OCTN2 and carnitine uptake in bovine kidney cells. Study 1 aimed to investigate the hypothesis that PPARalpha, as in rodents, regulates OCTN2 involving in carnitine uptake in cattle. MDBK cells were incubated 24 h with 150 myM of PPARalpha agonist WY-14,643 in the absence and presence of 10 myM of PPARalpha antagonist GW6471. WY-14,643 increased mRNA and protein levels of OCTN2, whereas co-treatment of MDBK cells with WY-14,643 and GW6471 blocked the WY-14,643-induced increase of mRNA and protein levels of OCTN2. The treatment of MDBK cells with WY-14,643 stimulated specifically Na+-dependent carnitine uptake in MDBK cells, which is likely the consequence of the increased carnitine transport capacity of cells due to the elevated expression of OCTN2. In addition, WY-14,643-stimulated increase of carnitine uptake was completely blocked by treatment of cells with GW6471. Study 2 aimed to investigate the hypothesis that PPARbeta/delta, like PPARalpha, also regulates bovine OCTN2 involving in carnitine uptake. MDBK cells were incubated for 24 h with 1 myM of PPARbeta/delta agonist GW0742 in the absence and presence of 10 myM of PPARbeta/delta antagonist GSK3787. GW0742 increased mRNA and protein levels of OCTN2, whereas co-treatment of MDBK cells with GW0742 and GSK3787 blocked the GW0742-induced increase of mRNA and protein levels of OCTN2. The treatment of MDBK cells with GW0742 stimulated specifically Na+-dependent carnitine uptake in MDBK cells. In addition, GW0742-stimulated increase of carnitine uptake was completely blocked by treatment of cells with GSK3787. Study 3 aimed to investigate the hypothesis that NF-kappaB has a similar function as PPARs in regulating bovine OCTN2 and carnitine uptake. Dose-dependent test was performed to find the optimized concentration of TNFalpha. 5ng/ml of TNFalpha increased the transcription level of IL-6 and IL-1B, which are the well-known NF-kappaB target genes. 5 ng/ml of TNFalpha stimulated NF-kappaB transactivation in MDBK cells. MDBK cells were incubated 24 h with 5 ng/ml NF-kappaB activator TNFalpha in the absence and presence of 1 myM of NF-kappaB inhibitor BAY 11-7085. TNFalpha increased mRNA and protein levels of OCTN2, whereas co-treatment of MDBK cells with TNFalpha and BAY 11-7085 blocked the TNFalpha-induced increase of mRNA and protein levels of OCTN2. The treatment of MDBK cells with TNFalpha stimulated carnitine uptake in MDBK cells. In addition, TNFalpha-stimulated increase of carnitine uptake was completely blocked by treatment of cells with BAY 11-7085. L-Carnitin ist ein wasserlöslicher Metabolit, der als essenzieller Kofaktor bei der beta-Oxidation von Fettsäuren dient, indem er langkettige Fettsäuren als Acylcarnitinester durch die innere mitochondriale Membran transferiert. Im Körper stammt Carnitin aus der endogenen Synthese und der intestinalen Resorption aus Nahrungsquellen. Gewebe, welche Carnitin nicht aus der endogenen Synthese gewinnen können, wie Skelett- und Herzmuskel, sind von der Aufnahme und Stoffverteilung im Körper abhängig. Der Carnitin-Transport wird durch den novel organic cation transporter (OCTN2) vermittelt, welcher natriumabhängig ist und eine hohe Affinität zu Carnitin aufweist. Der OCTN2-vermittelte Carnitintransport ist ebenso für die tubuläre Reabsorption von Carnitin in den Nieren verantwortlich und daher überaus bedeutsam, normale Carnitin-Spiegel im Serum aufrechtzuerhalten. Kürzlich durchgeführte Studien an Nagetieren haben überzeugend demonstriert, dass peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha), ein wesentlicher Regulator im Fettstoffwechsel und der Energiehomöostase, ein wichtiger transkriptionaler Regulator des OCTN2-Gens ist. Die Transkription wird durch PPARalpha initiiert, wenn Liganden, wie Fettsäuren, die während Energiemangel aus dem Fettgewebe freigesetzt und von anderen Geweben während dieses Zustands aufgenommen werden, oder exogene Liganden, wie Fibrate (WY-14,643), an die Ligandenbindungsdomäne dieses Transkriptionsfaktors binden. Im Gegensatz zu den Erkenntnissen bei Nagetieren, ist wenig bezüglich der Regulation von OCTN2 durch PPARalpha und seinen Isoformen PPARbeta/delta und ihrer Rollen beim Carnitintransport von Rindern bekannt. PPARbeta/delta und PPARalpha haben zum Teil überlappende Funktionen. Sie sind beispielsweise wesentliche Regulatoren im Fettsäurekatabolismus, da beide Subtypen die Expression von Genen kontrollieren, die Proteine kodieren, welche an der zellulären Aufnahme von Fettsäuren, dem intrazellulären Transport von Fettsäuren, der mitochondrialen Aufnahme von Fettsäuren und der mitochondrialen und peroxisomalen Fettsäureoxidation beteiligt sind. Obwohl die PPAR-Subtypen und nuclear factor kappa B (NF-kappaB), ein Schlüsselregulator der Entzündung, einen negativen Crosstalk aufweisen, werden während der Übergangszeit bei Rindern sowohl die PPAR-Subtypen, als auch NF-kappaB aktiviert. Es wurde nachgewiesen, dass die OCTN2-Expression und die Carnitin-Aufnahme in humanen Epithelzellen des Dickdarms durch den NF-kappaB-Induzierer tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) gesteigert werden. Jedoch ist unklar, ob NF-kappaB in der Lage ist, die OCTN2- und Carnitinaufnahme in Nierenzellen von Rindern zu verändern. Ziel der ersten Untersuchung war es, die Hypothese zu überprüfen, dass PPARalpha, wie bei Nagetieren, OCTN2 reguliert, welcher bei der Carnitinaufnahme bei Rindern beteiligt ist. Madin-Darby bovine kidney (MDBK)-Zellen wurden für 24 Stunden mit 150 myM des PPARalpha-Agonisten WY-14,643 in Abwesenheit und Anwesenheit von 10 myM des PPARalpha-Antagonisten GW6471 inkubiert. WY-14,643 erhöhte die mRNA und Proteinspiegel von OCTN2, wohingegen die Behandlung der MDBK-Zellen mit WY-14,643 und GW6471 die WY-14,643-induzierte Erhöhung von mRNA- und Proteinspiegeln des OCTN2 hemmte. Die Behandlung von MDBK-Zellen mit WY-14,643 stimulierte spezifisch die Na+-abhängige Aufnahme der Zellen von Carnitin, was vermutlich die Folge der erhöhten Carnitintransportkapazität der Zellen auf Grund der gesteigerten Expression von OCTN2 ist. Darüber hinaus wurde die WY-14,643-stimulierte Erhöhung der Carnitinaufnahme durch die Behandlung der Zellen mit GW6471 vollständig gehemmt. Ziel der zweiten Untersuchung war es, die Hypothese zu überprüfen, dass PPARbeta/delta, wie PPARalpha, den bovinen OCTN2 reguliert. MDBK-Zellen wurden für 24 Stunden mit 1 myM des PPARbeta/delta-Agonisten GW0742 in Abwesenheit und Anwesenheit von 10 myM des PPARbeta/delta-Antagonisten GSK3787 inkubiert. GW0742 erhöhte die mRNAund Proteinspiegel des OCTN2, wohingegen die Behandlung der MDBK-Zellen mit GW0742 und GSK3787 die GW0742-induzierte Erhöhung der mRNA- und Proteinspiegel von OCTN2 hemmte. Die Behandlung von MDBK-Zellen mit GW0742 stimulierte spezifisch die Na+-abhängige Aufnahme der Zellen von Carnitin. Darüber hinaus wurde die GW0742-stimulierte Erhöhung der Carnitinaufnahme durch die Behandlung der Zellen mit GSK3787 vollständig gehemmt. Ziel der dritten Untersuchung war es, die Hypothese zu überprüfen, dass NF-kappaB eine ähnliche Funktion wie die PPARs bei der Regulation der bovinen OCTN2- und Carnitinaufnahme haben. Es wurden dosisabhängige Tests durchgeführt, um eine optimierte Konzentration von TNFalpha herauszufinden. 5 ng/ml TNFalpha erhöhten den Transkriptspiegel von interleukin (IL)-6 und IL-1B, welche Zielgene von NF-kappaB sind. 5 ng/ml TNFalpha stimulierten die Transaktivierung von NF-kappaB in MDBK-Zellen. MDBK-Zellen wurden für 24 Stunden mit 5 ng/ml NF-kappaB-Aktivator TNFalpha in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 myM des NF-kappaB-Inhibitors BAY 11-7085 inkubiert. TNFalpha erhöhte die mRNA- und Proteinspiegel des OCTN2, wohingegen die Behandlung der MDBK-Zellen mit TNFalpha und BAY 11-7085 die TNFalpha-induzierte Erhöhung der mRNA- und Proteinspiegel von OCTN2 hemmte. Die Behandlung von MDBK-Zellen mit TNFalpha stimulierte die Carnitinaufnahme der Zellen. Darüber hinaus wurde die TNFalpha-stimulierte Erhöhung der Carnitinaufnahme durch die Behandlung der Zellen mit BAY 11-7085 vollständig gehemmt. Zusammenfassend ist die Erkenntnis aus dieser Dissertation, dass PPARalpha, PPARbeta/delta und NF-kappaB die OCTN2- und OCTN2-vermittelte Carnitinaufnahme in Nierenzellen von Rindern regulieren. Dies dürfte eine Erklärung für die kürzliche Beobachtung liefern, derzufolge der mRNA-Spiegel von OCTN2 und die Carnitin-Konzentration in der Leber von Hochleistungsmilchkühen während der frühen Laktation stark hochreguliert werden. Der erhöhte Carnitintransport könnte die Belastung durch Krankheiten, wie beispielsweise Ketose oder Fettleber vermindern, die bei Milchkühen durch eine negative Energiebilanz und Entzündungen hervorgerufen werden.