Entwicklung hochspezifischer Nickasen für gene targeting-Anwendungen

Abstract

Die gezielte Veränderung des genetischen Erbmaterials eröffnet u.a. die Möglichkeit Funktionen bestimmter Gene zu erforschen, ökonomisch wichtige Kulturpflanzen ertragreicher zu machen und ist vor allem auf dem gentherapeutischen Forschungsgebiet in den Fokus gerückt, da es einen enorm wichtigen Fortschritt in der Therapie gewisser Erbkrankheiten bedeuten könnte. Eine methodische Genom-Modifikation kann mit hochspezifischen Nukleasen erreicht werden, die eine singuläre Zielsequenz im Genom spalten. Je nach eingesetzter Nuklease können Doppel- oder Einzelstrangbrüche eingeführt werden. Die Reparatur des DNA-Schadens kann über homologe Rekombination (HR) in Anwesenheit einer homologen DNA-Reparatur-Matrix erfolgen oder alternativ, wenn eine DNA-Reparatur-Matrix fehlt oder nicht genutzt wird, kann ein Doppelstrangbruch den Reparaturmechanismus des non-homologous end-joining (NHEJ) stimulieren. NHEJ führt jedoch gewöhnlich zu Insertion und Deletion an der DNA-Bruchstelle, weshalb die Reparatur fehlerbehaftet ist. Daher wird dieser Ansatz für die gezielte Inaktivierung von Genen genutzt. Für Anwendung wie z.B. Gen-Korrektur oder Gen Insertion, können hingegen Nickasen herangezogen werden, die die HR stimulieren, NHEJ aber effektiv vermeiden und daher das Risiko für unerwünschte Mutationen senken. Im Rahmen dieser Arbeit werden drei innovative hochspezifische Nukleasen generiert und charakterisiert, die auf den DNA-Spaltungsmodulen MutH und HinP1I basieren. MutH und HinP1I sind monomere Endonukleasen, infolgedessen stellen die Fusionskonstrukte funktionale Monomere dar. Im Gegensatz zu dem häufig genutzten DNA-Spaltungsmodul FokI, sind MutH und HinP1I sequenzspezifisch für eine vier Basenpaare lange Erkennungssequenz, somit können zytotoxische Effekte durch unspezifisches Spalten der DNA weiter reduziert werden. Für eine sichere Anwendung ist zusätzlich die Funktion der DNA-Spaltungsmodule streng mit der Funktion des DNA-Bindungsmoduls gekoppelt, da die Nukleaseaktivität von Natur aus schwach ist, wie im Fall von MutH, bzw. bei HinP1I durch gezielte Mutationen vermindert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Fusion der katalytisch inaktiven Variante I-SceI bzw. der DNA-Bindungsdomäne des TALE-Proteins AvrBs4 an MutH eine hochspezifische Nickase generiert werden konnte, die eine adressierte Zielsequenz 1000-mal schneller spatete als eine unspezifischen Sequenz und keinerlei toxischen Effekte in E. coli hat. Darüber hinaus weist das Fusionskonstrukt TALE-MutH eine Strangpräferenz auf, die abhängig von dem Basenpaarabstand zwischen TALE- und MutH-Erkennungssequenz ist und daher steuerbar ist. Mit der Fusion der DNA-Bindungsdomäne des TALE-Proteins AvrBs3 und einer abgeschwächten Variante von HinP1I entsteht eine monomere hochspezifische Nuklease, die sowohl einen Doppelstrang-, als auch einen Einzelstrangbruch prozessieren kann. Hierbei ist ebenfalls der Abstand zwischen den Erkennungssequenz ausschlaggebend für den Spaltmechanismus. Dabei wird die adressierte Zielsequenz im Vergleich zu unspezifischen Sequenzen deutlich präferiert. Folglich wurden in dieser Arbeit zwei hochspezifische Nukleasen entwickelt, die für jede Art der Anwendung genutzt werden können, um komplexe Genome gezielt zu modifizieren. A defined modification of genetic material could be used effectively for the study of gene function, manipulation of relevant crop plants and gene therapy of inherited diseases. Gene modification by double strand break - or, preferably, single strand cleavage - induced homology-directed repair requires highly specific nucleases that target a unique sequence in a genome and the simultaneous supply of a suitably modified homologous DNA as a repair matrix. If the repair matrix is missing or not used a double-strand break is processed by non-homologous end-joining (NHEJ). This alternative repair pathway is frequently error-prone and therefore in principle can be used for targeted gene disruption; on the other hand, it is an unwanted side reaction for gene insertion and gene correction. To minimize this side effect highly specific nickases cleaving only one DNA strand can be used, since they stimulate HR but efficiently repress NHEJ and thereby lower the risk of unwanted mutations. In an effort to develop these novel highly specific nickases, fusion constructs of a DNA-binding module and the DNA cleavage modules MutH and HinP1I were generated and characterized. MutH and HinP1I, in contrast to active dimeric FokI which is a commonly used non-specific nuclease module, are monomeric endonucleases and have a four base pair long recognition sequence. Hence the risk of unspecific cleavage (off-target cleavage) that may lead to cytotoxic effects is reduced. In addition, the function of MutH and HinPI1 (adjusted by introducing suitable amino acid substitutions) is strictly linked to the function of the DNA binding module due to weak nuclease activity. It has been shown that fusing MutH with a catalytically inactive variant of I-SceI or the DNA binding domain of the TALE protein AvrBs4 results in highly specific nickases that cleave the addressed target site at least 1000-fold faster than an unaddressed site and shows no toxic effects in E. coli. Furthermore, the fusion construct TALE-MutH has a strand preference that can be controlled by the distance between the TALE and the MutH recognition sites. By connecting the DNA binding domain of the TALE protein AvrBs3 and a catalytically weakened variant of HinP1I a monomeric highly specific nuclease has been developed that can introduce a single-strand break - and depending on the conditions used - also a double-strand break. The cleavage mechanism depends on the distance of the TALE and HinP1I recognition sites. Cleavage of the addressed site in any case is clearly preferred over off-site cleavage. Thus, I succeeded in generating two nucleases that can be used for modifying a complex genome at a specific site.