Epigenetische Untersuchung von Tumorsuppressorgenen und deren Regulation durch CTCF

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des multifunktionalen Transkriptionsfaktors CTCF (CCCTC-Binding Factor) auf ausgewählte Tumorsuppressorgene untersucht. In die Analyse einbezogen wurden neben Mitgliedern der RASSF (Ras-Association domain family)-Familie, die Gene AATK (Apoptosis-associated tyrosine kinase) und DUSP2 (Dual-specificity phosphatase 2), die im Rahmen einer Transkriptomanalyse in Folge eines CTCF-Knockdowns in HeLa-Zellen eine signifikante Deregulation aufwiesen sowie tumorassoziiert sind und CTCF-Bindestellen besitzen. Die Charakterisierung der Kandidaten hinsichtlich epigenetischer Parameter ergab, dass eine Promotorhypermethylierung von AATK, DUSP2, RASSF5A sowie RASSF5C in verschiedenen Krebszelllinien mit einer reduzierten RNA-Expression korreliert. Eine Hypermethylierung der Promotoregion von AATK, DUSP2, RASSF5A sowie RASSF5C konnte zudem in primären Tumoren unterschiedlicher Krebsentitäten erfasst werden. Für AATK wurde mittels Colony Formation Assays eine tumorsuppressorische Wirkung nachgewiesen. Transiente CTCF-Überexpression führte zur methylierungsabhängigen Änderung der AATK-, DUSP2- und RASSF5C-RNA-Expression; d.h. eine Reexpression der Gene nach CTCF-Überexpression wurde nur bei Vorlage eines methylierten Promotors beobachtet. Die Überexpression der N-terminalen Domäne von CTCF resultierte in der stärksten Steigerung der AATK, DUSP2 und RASSF5C-Expression. Weiterhin führte die Mutation der CTCF-SUMOylierungsstellen und die Deletion der CTCF-PARylierungsstelle in Zellen mit methyliertem AATK bzw. DUSP2-Promotor zu inhibierter AATK bzw. DUSP2-RNA-Expression. Der Einfluss der SUMOylierung konnte ferner durch SUMO-Überexpressions-Experimente verifiziert werden. Die Depletion von CTCF führte in Zellen mit schwacher oder partieller Promotormethylierung von AATK-, DUSP2- oder RASSF5C zu reduzierter RNA-Expression des jeweiligen Gens, nicht aber zur signifikanten Änderung der Promotormethylierung. Das gezielte Einschalten von CTCF in einem stabilen System wurde durch Herstellung einer modifizierten HEK293-Zelllinie ermöglicht, die tetrazyklinabhängig CTCF exprimiert. Auch in dieser Zelllinie konnte die Reexpression von DUSP2 nach CTCF-Induktion beobachtet werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass CTCF methylierungsabhängig an den AATK-, DUSP2- und RASSF5C-Promotor bindet. Zudem konnte sowohl nach transienter CTCF-Überexpression, als auch nach CTCF-Induktion in den modifizierten HEK293-Zellen eine signifikante Abnahme der Hydroxymethylierung (5hmC) am methylierten DUSP2-Promotor detektiert werden. Das CTCF-Paralog BORIS hatte keine Auswirkung auf die RNA-Expression oder Methylierung der Kandidatengene. Durchgeführte Genomweite Methylierungs- und Expressionsanalysen wiesen ebenfalls daraufhin, dass CTCF die Hydroxymethylierung beeinflusst und konnten zur Identifikation neuer tumorassoziierter Kandidatengene beitragen, die in Folge einer CTCF-Expression eine epigenetische Aktivierung aufwiesen. In weiteren funktionellen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass TET1 in den Mechanismus der Regulation von DUSP2 über CTCF involviert ist. Insgesamt konnten in dieser Arbeit originäre epigenetische Regulationsmechanismen ausgewählter Tumorsuppressorgene durch CTCF beschrieben werden. In the present work, the influence of the multifunctional transcription factor CTCF (CCCTC - binding factor) was examined for selected tumor suppressor genes. The analysis included, besides members of the RASSF family (Ras association domain family), the genes AATK (apoptosis associated tyrosine kinase) and DUSP2 (dual specificity phosphatase 2), which showed in a transcriptome analysis in HeLa cells a significant deregulation in consequence of a CTCF-knockdown. Further AATK and DUSP2 are tumor associated and harbor CTCF-binding sites. The characterization of the candidates concerning epigenetic parameters revealed that a promoter hypermethylation of AATK, DUSP2, RASSF5A and RASSF5C is correlated with reduced RNA expression in various cancer cell lines. A hypermethylation of the AATK-, DUSP2-, RASSF5A- and RASSF5C promoter region could also be detected in primary tumors of different cancer entities. A tumorsuppressive effect was detected for AATK by colony formation assays. Transient CTCF overexpression altered the RNA expression of AATK, DUSP2 and RASSF5C, dependent on the promoter methylation status, meaning a re-expression of genes after CTCF overexpression was observed only in the case of a methylated promoter. Overexpression of the N-terminal domain of CTCF led to the strongest increase of the AATK, DUSP2 and RASSF5C expression. Further mutation of the CTCF SUMOylation sites and deletion of the CTCF PARylation site in cells with methylated AATK or DUSP2 promoter inhibited both, the AATK and DUSP2 RNA expression. The influence of SUMOylation was verified by SUMO-overexpression experiments. The depletion of CTCF in cells with weak or partial promoter methylation of AATK, DUSP2 or RASSF5C resulted in reduced RNA expression of each gene, but not in significantly altered promoter methylation. To specifically switch on the CTCF-expression in a stable system, a modified HEK293 cell line was created, that expresses CTCF tetracyline depended. Also in this cell line, the re-expression of DUSP2 after CTCF induction was observed. Furthermore, it was shown that CTCF binds methylation dependent to the AATK, DUSP2 and RASSF5C promoter. Moreover a significant decrease in the hydroxymethylation (5hmC) at the methylated DUSP2 promoter after transient CTCF overexpression, as well as after CTCF induction in the modified HEK293 cells was detected. The CTCF paralog BORIS had no effect on RNA expression or methylation of candidate genes. Genome-wide methylation and expression analysis also pointed out, that CTCF affects the hydroxymethylation and could contribute to the identification of new tumor-associated candidate genes, that showed an epigenetic activation as a result of CTCF expression. In further functional studies it has been shown that TET1 is involved in the mechanism of regulation of DUSP2 via CTCF. Overall distinct epigenetic regulatory mechanisms of selected tumor suppressor genes by CTCF could be described in this work.